本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中Cortisol的浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。如有其它疑问请登录科创生物公司网站或致电本公司。
（一）简介
皮质醇，也叫氢化可的松，或氢皮质素或化合物 F（compound F），是从肾上腺皮质中产生的对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素，即属于糖皮质激素的一种。皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的 11β-羟化酶的作用，由 11-脱氧皮质醇生成。皮质醇也可通过 11-β-羟类固醇脱氢酶（11-β-hydroxysteroid dehydrogena－se）的作用变成皮质素。压力状态下身体需要皮质醇来维持正常生理机能；皮质醇在操纵情绪和健康、免疫细胞和炎症、血管和血压间联系，以及维护结缔组织（例如骨骼、肌肉和皮肤）等方面具有特别重要的功效。压力状态下，皮质醇一般会维持血压稳定和控制过度发炎。
（二）检测原理
皮质醇试剂盒采用竞争法检测原理。在酶标板预包被了高特异性识别皮质醇的抗体，同时加入样本和 HRP 连接的皮质醇结合物，样本中皮质醇与皮质醇结合物竞争性结合酶标板中包被的抗体。洗去游离的未结合的皮质醇与皮质醇结合物，加入 TMB 底物，与抗体结合的皮质醇结合物上带的 HRP 就会催化底物 TMB 反应，颜色显蓝色，中止后显黄色。如果样本中皮质醇含量越多，则与包被的抗体结合的皮质醇结合物则越少，颜色则越浅，即颜色与样本中的浓度成反比。
本试剂盒主要用于定量检测人血清、血浆，唾液及细胞上清中的皮质醇含量。
（三）试剂盒组成
1、预包被板 12 条/6 条(96T/48T)；
2、标准品 2/1 管(96T/48T)，每管 1ml,浓度为 10ng/ml：使用时直接取用稀释好的标准品为 10ng/ml,作为最高浓度，再用样本稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取八个点，最高浓度为 10ng/ml,样本稀释液直接加入作为 0 浓度.）
3、样本稀释液，1 瓶 16ml/8ml(96T/48T)；标准曲线中 0 浓度标准品以样本稀释液直接加入。
4、冻干皮质醇 HRP 酶结合物，2 瓶/1 瓶(96T/48T)
5、TMB 底物溶液，1 瓶 10ml/5ml(96T/48T)； 6、中止液，1 瓶 5ml； 7、浓缩洗涤液（20×），1 瓶 30ml/15ml(96T/48T)； 8、封板纸 3 张/2 张(96T/48T)； 9、说明书一份；
（四）检测中需要自备的材料：
1、振荡混匀器。
2、可控温水浴箱 37℃。 3、ELISA 酶标仪（450nm）。
4、移液枪头等
（五）注意事项：
1、未开封的试剂应保存在 2－8℃。包装箔袋开封后，应立即封紧。开封后的包被微孔板储存在 2－8℃下可以稳定 6 个星期。
2、所有试剂和所需的微孔板条在使用前应平衡至室温。
3、使用前将浓缩洗涤液用蒸馏水按 1：20 稀释（例如：10ml 浓缩洗涤液应用蒸馏水稀释至终体积 200ml）。
4、稀释后的洗涤液在 2－8℃下可以保存 4 个星期。
5、样本收集 血清和 EDTA 处理的血浆样本。避免使用明显溶血、黄疸、脂血样本。使用的血清和 EDTA 血浆样本，按常规方法制备。样品在 2－8℃下保存不超过 24 小时。如果样品需要长期存放（3 个月以上），应冻存在－20℃。使用过程中应避免反复冻融。
6 细胞上清样本需要 10 倍稀释，唾液样本一般需要 5 倍稀释后检测，血清血浆样本需酸化将与蛋白结合的皮质醇释放出来再检测，具体方法如下：100μL of serum or plasma 加入 100μL 新配 0.6N 的三氯乙酸，混匀后，25~28 度孵育 15 分钟，离心力大于 12000g 的速度，离心 4 分钟，取上清 100μL，再加入 100μL 的碱液中和成中性液体，此时样本已被稀释 3 倍。上面处理后的样本可再稀释 20 倍后再检测。
（六）检测过程：
所有的试剂和样本在使用前应平衡至室温并摇匀（摇匀过程应保证无泡沫产生）。一旦检测开始，应连续操作，不中断。开始分析前，推荐准备好所有试剂，打开瓶盖，将所需微孔板条固定等等，以防止实验中出现不必要的时间拖延。使用每种试剂、标准品或样品时，都应更换一次性移液枪头，以免交叉污染。
（七）检测步骤：
1、将所需微孔板条在微孔架上固定；
2、分别移取梯度稀释后 100ul 标准品以及样本至相应微孔中；整个加样时间间隔时间不宜超过 10 分钟，否则可能影响检测结果。
3、提前用样本稀释液每瓶加 3.3ml 复溶 15~20 分钟,每孔加入 50ul 酶结合物，充分混合 10 秒钟。25-28℃避光孵育 120分钟。酶结合物复溶后，不能保存，未用完的剩余部分建议丢弃。
4 、用洗涤液将微孔洗涤 3 次（推荐使用洗板机）。
（八）重要提示：
如果是手工洗板，洗涤液加入板孔中，需浸泡 20~60 秒，最后一次必须在干净的吸水纸上用力拍打微孔，除去残留洗涤液。洗涤操作的正确与否将影响整个实验分析的灵敏度和精密度。
5、 每孔加入 100ul 底物溶液。室温避光孵育 20 分钟（25-28℃）。
6、每孔加入 50ul 中止液，终止酶反应。并在 450nm 处测定 OD 值（参考波长 600－650nm）。读取 OD 值最好在 10 分钟内完成。
（九）结果计算：
在半对数图纸上，以标准品的浓度作为横坐标（对数刻度），对应的 OD 值作为纵坐标（线性刻度）。或者，以每个标准品对应的 OD 值除以零浓度对应的 OD 值，OD/OD0，即结合率，作为纵坐标。如果使用软件绘图，采用 cubic spline，4 参数（4 Parameter Logistics）或者 Logit-Log 曲线绘制标准曲线，可使曲线拟合的更好。样品浓度可以根据测得的 OD 值，直接从标准曲线上读取。任何样品浓度如果高于最高标准品浓度，样品应用零浓度标准品作适当稀释后重新测量分析。所得结果乘以稀释倍数后即样品实际浓度。下表列出了皮质醇 ELISA 分析后的典型标准曲线，此数据仅供参考，不能代替任何时间所得的分析数据。
下图是皮质醇参考标准曲线
（十）试剂盒相关性能参数：
1 重复性：板内，板间变异系数均<10%.
2 灵敏度经重复验证，本试剂盒最低可检测的皮质醇浓度为 78pg/ml。 3 特异性本试剂盒对各种类似固醇类小分子化合物的交叉反应性见下表：
参考文献:
1. Goodyer, I.M. et al. (1996) Psychol. Med. 26:245.
2. Whitworth, J.A. et al. (2000) Hypertension 36:912.
3. Arriza, J.L. et al. (1987) Science 237:268.
4. Chrousos, G.P. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1351.
5. Hollenberg, S.M. et al. (1985) Nature 318:635.
6. Tomlinson, J.W. et al. (2004) Endocr. Rev. 25:831.
上一篇：科创生物：结直肠癌早筛
