免疫标记技术是目前应用非常广泛的一门免疫学检测技术，它在检测的特异性、敏感性与快速性上，以及对抗原、抗体的定量、定性、定位检测方面，较之血清学方法都有很大的进步与提高。免疫标记技术的基础，是将试剂抗体或抗原用可以微量检测的标记物进行标记，包括放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂、镧系元素、金属微粒等。形成的标记抗体或抗原，既保留其抗原抗体特异性结合的活性，又具有标记物的示踪特性。标记抗体或抗原的制备方法因标记物的不同而异，但基本过程相类似，包括抗体/抗原与标记物的联接、标记抗体/抗原的纯化和质量鉴定三个步骤。
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)是目前最常用的荧光抗体标记物。在碱性溶液中，FITC上的化学基团异硫氰基(-N=C=S)与抗体蛋白的自由氨基(主要是赖氨酸的e-氨基)结合，形成荧光抗体。荧光素标记抗体的纯化采用凝胶过滤法，又称分子排阻层析或分子筛层析，是以多孔网状结构凝胶颗粒作为层析介质。每种型号的凝胶颗粒，其所具有的海绵状立体网孔结构的孔径较一致，犹如分子筛一样，可以分离一定大小的分子。当不同大小分子的混合物加至柱表面时，大分子不能进入胶粒的网孔内，在胶粒之间的空隙中向下移动，首先被洗脱；而小分子则在下移的过程中，可不断进入胶粒的网孔内而反复遇阻，下移速度慢，逐渐与大分子分开，因而后被洗脱。本实验根据所提纯的分子大小采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25，分离荧光素标记抗体与游离荧光素。
【主要试剂与器材】
1.抗体。
2.异硫氰酸荧光素(FITC)。
3.葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)。
4.0.5mol/L pH9.5碳酸缓冲液。
5.0.005mol/L pH7.0磷酸缓冲液。
6.紫外分光光度计、铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒。
7.烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、标准曲线纸、pH试纸、黑纸或铝箔。
【操作方法】
1.抗体标记
(1)取已知浓度的抗体蛋白溶液，用0.5mol/L pH9.5碳酸缓冲液稀释至最终浓度为20mg/ml。置于有盖的称量杯中，并放入磁棒用黑纸包好。
(2)称取适量的FITC：按FITC/抗体蛋白的质量比为1/100，计算出需要的FITC量。即，待标记抗体蛋白总量(mg)×0.01 = FITC的量(mg)。
(3)将称好的FITC放在试管中，并用黑纸包好，然后取相当于稀释后抗体蛋白溶液体积1/10的0.5mol/L pH9.5碳酸缓冲液溶解FITC。
(4)开启搅拌器，将FITC溶液用毛细滴管逐滴滴入含抗体蛋白溶液的称量杯中，加完后用pH试纸测试，如pH低于9.5，则用0.2mol/L NaCO3调整pH至9.5，室温下加盖搅拌1h。
2.用Sephadex G-25装层析柱
(1)用蝴蝶夹将玻璃层析柱垂直固定于铁立架上，于柱内加入约1/3柱高的0.005mol/L pH7.0磷酸缓冲液，赶尽孔腔内的气泡，关紧止水夹。
(2)将经过缓冲液平衡过的Sephadex G-25凝胶轻轻搅匀，沿管壁缓缓加满层析柱，待凝胶下沉压积约1cm 高度时打开止水夹，控制流速为每分钟20～30滴。
(3)将凝胶不断搅拌加入层析柱，直至凝胶沉积面离管口4～5cm为止。
(4)接上0.005mol/L pH7.0磷酸缓冲液，流穿层析柱平衡45min。
3.标记抗体的纯化
(1)上述搅拌1h后的标记液上Sephadex柱，上样量为柱床体积的1/6～1/10为宜。
(2)0.005mol/L pH7.0磷酸缓冲液洗脱，控制流速为每分钟20～30滴，可见标记物逐渐向下移动并分离成2个节段，走在前面的淡黄绿色(荧光素标记抗体)和走在后面的黄色(荧光素)节段。
(3)用三支试管收集：待淡黄绿色成分走至离下端2cm时，用第一支试管开始收集；当淡黄绿色成分出现在洗脱液时，用第2支试管收集黄绿色液体；待淡黄绿色将消失时，收集第3管。
4.洗脱物测A值
(1)第2管洗脱物作适当稀释，使测出的A值在0.2～0.7范围内为宜，此时分光光度计的准确性较高。
(2)紫外分光光度计开机预热，用0.005mol/L pH7.0磷酸缓冲液调零。
(3)分别测上述三管洗脱物的光密度A值,记录A495与A280的读数。
【结果判断】
根据A值，按下列公式计算荧光素与蛋白结合比例F/P值：
F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，标记抗体的灵敏度就高，但F/P过高会增加荧光素标记抗体的负电荷，从而增加与组织细胞的非特异性吸附。一般用于固定样品的荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细胞的以F/P=2.4为宜。
【注意事项】
1.影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白的量等，需注意控制。
2.荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适当以避免气泡产生。
3.层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气泡、裂隙。
4.上样和洗脱时应做到“前切”和“后切”。“前切”指柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品；“后切”指样品走至与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。
【应用与评价】
荧光素标记蛋白质的常用方法有搅拌法(本实验使用)和透析法两种。搅拌法的优点是标记时间短、荧光素用量少。但本法的影响因素多，操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。透析法适用用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液，此法标记比较均匀，非特异性染色也较低，但标记时间较长。
