藻红蛋白（R-phycoerythrin）是稳定亲水的蛋白分子，其独特的光谱特性和敏感性使之成为理想的荧光标记物，在流式细胞术多色分析中已获得广泛应用。抗体-藻红蛋白（R-PE）标记技术及藻红蛋白（R-PE）-Cy3抗体（即Cy3或Cy5PE-Ab）的标记也亦受到重视，尤其是应用在蛋白芯片的基因检测及免疫组化上，都在研制高精度的标记物和应用上。【科创生物】
荧光抗体的制备方法较多，目前比较常用的是直接标记法。而异双功能试剂使交联方法大为简化，在交联过程中，使用交联剂的量对交联物的影响很大，这就要在试验研究中提出交联剂的选择及其浓度的确定、抗体与R-PE交联的E-PE时的浓度、R-PE结合物的纯度和鉴定。【科创生物】
●试剂及其制备：【科创生物】
1、藻红蛋白：分子量约 240000 道尔顿（240KDa）；
2、PBS Buffer pH 7.4 0.1 M 磷酸盐缓冲液；
3、Sephacryl S-300HR 排阻极限为300kD Pharmacia公司【科创生物】
4、PD-10 柱 ( 葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G -25M ) ，安玛西亚 Amersham 公司产品 , 产品目录号 No. 17-0851-01 or No 17-0853-02；
5、琥珀酰亚胺 -4-(N-甲基马来酰亚胺 ) 环已烷 -1- 碳酸酯 )(SMCC) ，Pierce 公司 , 产品目录号 No. 22360；SMCC用无水DMSO溶解，其浓度为5mg/ml，现用现配；
6、SPDP：用无水乙醇溶解，其浓度为1.4mg/ml现用现配；【科创生物】
7、N- 乙基马来酰胺（ NEM ）， Sigma 公司 , 产品目录号 E-1271 ；
8、无水二甲基亚砜（ DMSO ），电镜级；
9、二硫苏糖醇（ DTT ）Sigma D9779 用PBS制备浓度为154mg/ml；
10、碘乙酸钠：用PBS制备浓度为20mg/ml；
11、保存缓冲液：称取1.42g Tris 8.0；8.77g NaCl；少量双蒸水溶解后定容至1L，加3-4滴pHix （五氯酚） pH 8.2；
●试验方法【科创生物】:
本方法的基点是基于：R-PE与交联物SMCC的比例为1:8；SPDP与单克隆抗体交联物的比例为20:1；两交联物结合物的比例（R-PE-SMCC:与SPDP-为抗单）为1:1.60
1、R-PE预处理：R-PE的定量：将Millipot超过滤管称重后，取出一个包装或大约5mg/ml的60% SAS保存的R-PE，10000rpm 10min，除盐，再称重，其差即为R-PE的实际重量。用pH 值 7.4 的 0.1M磷酸盐缓冲液（ PBS ）【科创生物】 调整E-PE浓度至 5-10 毫克 / 毫升为宜。4℃保存。
R-PE纯度及浓度的测定：【科创生物】
（1）制备R-PE浓度为1mg/ml,用紫外分光光度计分别测定280、565及620nm OD值。
R-PE浓度为1mg/ml紫外分光光度计波长565nm测定R-PE的特征吸收峰值，OD值应为8.2。表明PE纯度是符合要求的；
565/620nm 比率应﹥50 （620nm/565nm比值﹥0.02）；
565/260nm的比率﹥5表明R-PE含有其他蛋白，应再上柱进一步纯化，去除其他蛋白。【科创生物】
（注意：供应商提供的60%SAS R-PE浓度为5mg/ml支。在预处理R-PE时，应考虑标记试验所需要的R-PE量及标记时R-PE损失10%的量。建议其浓度为10mg/ml。）
（2）R-PE脱盐处理及R-PE脱盐处理后的浓度确定：
a 取保存在60% SAS中的R-PE 2.0ml（10mg左右），放入透析袋中，以0.1M pH=7.0-7.2 PBS进行透析（过夜），其中换液2次（以纳氏试剂检测不含NH4）。
b 取出脱盐处理后的R-PE，适当稀释（记录稀释倍数）于564nm测定其A max OD值，减去空白对照（Amax 吸光度最佳在0.3 - 0.8 cm-1范围内）。【科创生物】
c 按下列公式计算R-PE的浓度：
RPE mg/ml]= 0.122 x Undiluted Amax （mg/ml）【科创生物】
上式中：0.122 系数 Undiluted Amax mg/ml为【科创生物】脱盐后564nm处测得A max-空白值×R-PE稀释倍数
2、R-PE的衍生化（R-PE－SMCC）：
交联剂SMCC两端分别是NHS-酯和顺丁烯二亚胺基团，藻红蛋白先与SMCC进行NHS反应，活化藻红蛋白。
（1）SMCC母液的制备：
称取一定量的SMCC，加入DMSO 使之浓度为10mg/ml（SMCC制备的浓度若﹤4mg/ml，则只能保存3周，﹥4mg/ml以上，则4℃可长期保存）。
（2）按每mg的R-PE 加 11 µl SMCC 母液(注意：R-PE与SMCC摩尔比为1:8) ，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟，使R-PE分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的藻红蛋白。
上柱（PD-10 ），将衍生化的藻红蛋白过柱，收集藻红蛋白峰。备用。
3、抗体（ IgG ） 的处理【科创生物】
巯基化mAb衍生物的制备：
取纯化的抗体1ml（2.5～5.0mg/ml），加入30 µl SPDP，铝箔封好后于室温孵育90min（SPDP:mAb=20:1）。过柱，收集巯基化mAb衍生物（去除未结合的游离SPDP及未标记的mAb）。【科创生物】
DTT处理SPDP-mAb：
将30µl DTT（0.5M、77mg/ml 终浓度）加到交联好的SPDP-mAb中，室温孵育30min。过柱，去除多余DTT。
终止反应：加入80µl 0.1mM N-乙烷基顺丁烯抱亚胺（NEM）【科创生物】，室温振荡孵育30min终止反应。
4、交联反应 R-PE-SMCC衍生化物:巯基化mAb混合（其比例为1:1.6）,低速摇床反应12小时。
5、PE标记抗体mAb的分离：将标记抗体适当浓缩后，上柱收集mAb-PE。
PBS洗脱，控制流速0.3ml/min。首先是mAb-PE（MW约400 kDa）出峰，其余依次是游离R-PE（MW 240kDa）和游离mAb（MW 150kDa）。收集mAb-PE（MW约400 kDa）峰液。【科创生物】
6、流式细胞仪鉴定：荧光抗体作为二抗与相应【科创生物】细胞反应检测R-PE标记效率。
注意：
1、在SMCC与R-PE交联时，其最佳比例为8:1。
2、在SPDP与抗体交联时，其mM(M)比，为20:1
3、在交联时需控制SMCC的浓度，在上述的比例中，既可保证100%抗体的生物学活性，更可得到交联物的相对荧光强度。
4、随SMCC用量增加（即SMCC:R-PE摩尔比值）,虽然交联物的相对荧光强度增加，但是其抗体的生物学活性降低。试验时，控制SMCC:R-PE的比例是试验结果的重要条件。
附：关于 SMCC与R-PE 和 SPDP与mAb 比例的计算：
1、SMCC与R-PE
SMCC与R-PE的最佳比例=8:1，即8.0µM SMCC :1.0µM R-PE
SMCC WF=334.3 R-PE WF=240000
1.0µM SMCC=0.3343µg／ml
1.0µM R-PE=240µg／ml
即0.3343×8=2.67µg/ml R-PE为240µg/ml
若1.0mg R-PE 则需加入10mg/ml SMCC 11.5µl（或按比例制备）。
2、SPDP与mAb
SPDP 与 mAb 的比例为20:1,即20mM SPDP : 1.0mM mAb
SPDP WF=312.4 mAb WF=150000
1.0µM = 0.3124µg／ml
1.0µM = 150µg／ml
SPDP 0.3124×20=6.248µg／ml
mAb 150µg／ml
若mAb浓度为5mg，即需加入SPDP 208.3µg（每1mg mAb需加41.7µgSPDP，或按比例计算）。
3、R-PE浓度的定量测定【科创生物】
按照公式：RPE mg/ml]= 0.122 x Undiluted Amax （mg/ml）
【（注：Net A = A –空白对照 ；Undiluted A = Net A x 稀释倍数； Amax 吸光度最佳在0.3 - 0.8 cm-1范围内。）确定藻红蛋白浓度】。
3.1公式中Undiluted A max，是指：脱盐后的R-PE在您所使用的仪器上所测最大吸收峰处的吸光度（但要扣除空白对照的影响），和您测试时的实际稀释倍数相乘的结果，再乘以0.122就是您所测试的实际浓度，这个结果可能与我的定量浓度有差异；
3.2 公式中 A max 是指：您的测试仪器通过200nm~700nm所测连续吸收峰而确定的R-PE最大吸收峰处的吸光度。如果您非常确定您的仪器很准确，所测吸收峰图不会产生偏移，可直接在564nm处测得A max 。
3.3 关于空白对照，我们一般建议选用溶解R-PE时缓冲液（0.1M pH=7.0-7.2 PBS）脱盐后更准确，含盐的话会有所影响 。
4、R-PE脱盐处理及R-PE脱盐处理后的浓度确定：【科创生物】
4.1 取保存在60% SAS中的R-PE 2.0ml（10mg左右），放入透析袋中，以0.1M pH=7.0-7.2 PBS进行透析（过夜），其中换液2次（以纳氏试剂检测不含NH4）。
4.2 取出脱盐处理后的R-PE，适当稀释（记录稀释倍数）于564nm测定其A max OD值，减去空白对照（Amax 吸光度最佳在0.3 - 0.8 cm-1范围内）。
4.3 按下列公式计算R-PE的浓度：
RPE mg/ml]= 0.122 x Undiluted Amax （mg/ml）
上式中：0.122 系数
Undiluted Amax mg/ml为脱盐后564nm处测得A max-空白值×R-PE稀释倍数【科创生物】
