声明：引自【LGC基因组学】，科创生物尊重知识产权，重视原创！向原创作者致敬！感谢将知识分享给行业内工作者！
Q1：啥是多重荧光定量PCR？！
简单的说，就是把多管不同基因靶标的PCR反应混合在一起，放在同一个管子里做。在多重荧光定量PCR反应体系中，不同的检测靶标理论上都是平行扩增、独立检测的。
Q2：这有啥好处呢？
一方面，在同一个反应体系里的不同PCR过程，理论上可以极大的避免因加样差异、板孔位置等系统误差导致的数据波动；另一方面，通过在一个体系中对不同靶标的同时分析，不仅节省了样品和试剂以及耗材的用量，也提高了检测的效率。
大多数小伙伴们‘闻多重而色变’，认为多重荧光定量PCR是个成功率低、优化困难、优化成本极高的‘伪命题’，而且对酶和反应条件比较苛刻，事实确实如此。
不过今天不同了，因为小编发现了一条通往光明的捷径【敲黑板！！！】：有一套简明的在线工具可以协（mian）助（fei）设计，也有一系列针对多重荧光PCR专门优化过的试剂节约您优化的时间和成本。
众所周知，设计一对引物就要考虑二聚体、特异性等等问题；要想把多组引物甚至探针放在一起使用，更需要注意兼容性、扩增效率一致性等不胜枚举的复杂问题。
在这里小编不想将这些问题一一展开（我猜您也没兴趣看）。因为，自从有了如下这款软件，老板就再也不用担心我的探针设计问题了：RTD多重荧光定量PCR设计工具统统帮您考虑好了！
设计多重引物探针，仅需三步：
登录在线软件
贴入待测的若干序列（.fasta格式）
选择多重设计模板（multiplex）后点击确认
剩下的就交给软件啦！
那么这款软件的效果到底有多好？作为科学工作者，咱们用数据来说话：A Rapid Bioinformatic Engine for Multiplexed qPCR Design
如果您按照上述步骤设计探针，在得到结果前，您会被软件质问：亲爱的，请问您要使用哪些荧光？！面对这个问题，小编一开始也是慌张的：太难了！别怕，立刻给您第二个法宝：Spectral Overlay Tool for Multiplexed qPCR
【可参考：https://dwz.cn/W80n2XHp】
该工具罗列了主流的荧光基团及对应的淬灭方案。当您不确定荧光间的相互干扰情况时，可以利用此工具再模拟一下看看， 具体如下：
挑选合适的染料
多重荧光定量PCR中，每一根探针都需要一个独一无二的荧光修饰（特异性）和一个性能足够好的淬灭修饰（抑制背景信号），这样才能够在多重反应中，准确的确定有没有靶标扩增、是哪个靶标扩增。荧光选择多种多样，需要根据仪器决定，在可选范围内，挑选彼此距离远的为佳（LGC, Biosearch Technologies提供10多种波段的选择，足够了！）；淬灭修饰的选择就简单多了——公认通用BHQ。
模拟干扰情况
选定心仪的荧光组合后，可利用上述软件，模拟观察交叉干扰情况。如右图：展示了 Rotor-Gene™ Q在进行5色荧光定量检测时最佳的染
料组合。
找到合适的工厂生产探针
这一步听起来容易，但是要找到可靠的多色荧光探针的厂家困难重重，对于实际应用而言，进行选择时，主要考虑以下几点：
（1）荧光选择是否足够：
仪器多种多样，荧光需求大不相同。目前，能够可靠生产10种不同波长荧光，并且拥有相应版权的厂家小编只认LGC, Biosearch Technologies一家（听说这家正是30多年前给PCR发明人Kary Mullis提供PCR引物的工厂）
（2）淬灭修饰是否有效：
荧光定量PCR检测的基础之一在于：不反应的时候荧光被有效抑制。然而能够做到从紫外到红外光全都有效抑制的基团，小编也只认BHQ系列淬灭技术（听说淬灭界的金标准，居然也是LGC, Biosearch Technologies发明的。求证！）
（3）生产工艺是否可靠：
虽然探针随处买得到，但是您真的有检查过质控报告吗？纯度是否足够？纯化技术用的是什么（冷知识：HPLC技术都分AX-HPLC和RP-HPLC两种）您的用对了吗？等等。。。质量不够的探针，要么反应前荧光就已经释放（导出都是信号），要么怎么反应都没有荧光发出（已然永久淬灭），自然浪费您宝贵的实验精力。这也是为什么更多国际主流机构和厂家纷纷选择LGC, Biosearch Technologies。近40年的生产经验，放心！
总结：
搞定了引物探针设计，选择好了荧光和淬灭的修饰，找到了可靠的生产厂家。那么您已经达到了美国FDA的水准了【可参考：https://dwz.cn/2EeAf8uA】，因为他们在官方推荐的5重荧光定量PCR试剂盒中，用的也是这个。
