共刺激分子的生物学特性及其在免疫应答中的调节作用和临床意义
适应性免疫应答是一个由多种免疫细胞和分子参与并受到严格调控及制约的过程。共刺激分子及其调节网络在免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止过程中起着极其重要的调节作用。根据所介导的信号性质，共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子，或称之为共刺激分子（costimulatory molecules）和共抑制分子（coinhibitory molecules）。随着新的共刺激分子成员不断地被发现、克隆、相关生物制剂（包括重组细胞因子和单克隆抗体）的成功研制，以及在转化医学中取得的巨大成就，共刺激分子及其构成的调节网络学说极大地丰富了免疫学基础理论的内涵，并且在感染性疾病、肿瘤免疫、自身免疫性疾病、超敏反应及免疫移植排斥等发病机制和防治中起着越来越重要的作用[1-3]。
第一节 共刺激分子在免疫应答中的特性与作用
一、 共刺激分子的生物学特性与功能
（一）共刺激分子分类
共刺激分子根据其结构可分为两类：①TNF/TNFR 超家族，包括CD27/CD27L、CD30/CD30L、CD40/CD40L、OX40/OX40L、4-1BB/4-1BBL、RANK/RANKL、TNFR/TNF、HVEM/LIGHT、Fas/FasL等；② 免疫球蛋白超家族（immunoglobin superfamily，IGSF），其中由三大类分子组成。CD28/B7家族：CD28/B7.1·B7.2、CTLA4/B7.1·B7.2、PD-1/PD-L1·PD-L2、? /B7-H3、ICOS/GL50（B7RP-1、B7-H2）、? /B7-H4、? /B7-H5、NKp30/B7-H6、CD28H /B7-H7、BTLA·CD160/HVEM、TIGIT/CD155·CD112等；Tim家族和SLAM （signaling lymphocyte activation molec）家族：Tim-1、Tim-2､Tim-3、Tim-4和相关分子等，以及SLAM (CD150)、 2B4 (CD244)、Ly-9 (CD229)、NK-T-B抗原（NTB-A）、CD84和CD2样受体。
根据其功能可分为：（1）正性共刺激分子：CD28/B7.1·B7.2、ICOS/GL50（B7RP-1、B7-H2）、4-1BB/4-1BBL、CD40/CD40L、HVEM/LIGHT等；（2）负性共刺激分子：CTLA4/B7.1·B7.2、PD-1/PD-L1（B7-H1）/PD-L2（B7-DC）、?/B7-H3、?/B7-H4、BTLA·CD160/HVEM等。
（二）共刺激分子的生物学特性
在适应性免疫应答启动过程中，抗原提呈细胞和T细胞之间形成免疫突触参与T细胞活化。“突触”源于希腊语，即“接触”的意思。Paul和Seder等借鉴生理学“神经突触”和“神经肌肉连接”概念而首先提议使用“免疫突触”的概念[4]。Anton等认为，CD4+ T细胞和APC经过表面分子的重新分布，伴随着细胞骨架的极化，在细胞接触面形成了有序的免疫突触，在CD8+ T细胞和NK细胞也发现类似的有序界面，这表明它们可能是淋巴细胞活化的共同特征。免疫突触在T细胞活化中起重要作用，并有多种共刺激分子如CD28/B7.1、ICAM-1/LFA-1等参与，进而调节免疫突触的形成和信号转导。CD28的结合促进了细胞骨架上细胞表面蛋白、富含激酶的脂筏和接合体蛋白的募集，有利于免疫突触的形成。免疫突触又形成了CD28/B7.1·B7.2等共刺激分子相互作用的微环境。由此，免疫突触中CD28通过信号分子与肌动蛋白的连接，可以防止信号分子的蛋白酶水解作用，从而延长TCR信号[5]。LFA-1/ICAM-1诱导T细胞的骨架向新形成的T细胞-APC交界面移动，在免疫突触的形成过程中亦发挥重要作用。免疫突触可提高TCR与MHC—肽复合物相互作用的亲和力、促进与T细胞信号转导相关分子的相互作用及促进T细胞发挥效应功能。
共刺激分子及信号传递具有如下特性：①这些分子均是以受体与配体相互作用的形式介导信号，信号的传递往往是双向性的（即受体与配体表达细胞均可同时接受到相应的信号和产生生物学效应）；②受体和配体通常表达在不同的靶细胞上，其中一个呈持续性表达，另一个为诱导性表达；③ 在不同免疫应答阶段，这些分子可能是以一定的程序和各自独特而又相关的方式参与的，既相互调节又相互协同，从而形成调节网络；④ 共刺激分子，不论受体或配体，均存在膜型和可溶性两种形式，表达于细胞膜上和分泌于体液中，均参与了共刺激信号的介导和自身调节；⑤负性共刺激分子是机体免疫系统在长期进化中形成的调节机制，使得免疫应答更为精确的调节，防止对自身组织因应答过度所致的损伤，维持内环境的稳定。鉴此共刺激分子不仅激发或增强免疫应答，还作为免疫卡控点（immune checkpoint）分子介导下调或中止免疫应答的信号。
二、 共刺激分子调节网络及其功能
（一）共刺激分子参与免疫应答的启动和放大过程
免疫应答过程中，T细胞激活的关键性起始环节是T细胞的抗原受体TCR与表达APC表面的主要组织相容性抗原（MHC）分子抗原肽复合物相互作用，然而单纯TCR-抗原肽-MHC分子的相互作用并不能诱导T细胞的有效活化，而会导致免疫低反应性或无反应性，甚至免疫耐受。业已证实，有许多表面分子参与T细胞的激活。TCR和MHC-抗原肽相互作用后，一些免疫分子如黏附分子和共刺激分子将呈上调性表达，这些分子与APC表面的配体结合通过加强T细胞-APC相互作用而参与起始阶段的信息传递，其中T细胞CD40L的上调表达，是T细胞初始活化过程中的关键环节。CD40L与由APC如树突状细胞（DC）表达的CD40相互作用启动了T细胞活化所必需的重要共刺激信号，继而由诱导性上调表达在APC的B7.1及B7.2和T细胞表达的CD28相互作用，启动了T细胞有效活化。
CD28/B7介导的共刺激作用对初次免疫应答的诱导是必需的，但它不直接参与再次（回忆）免疫应答；CD28/B7信号主要涉及到APC与T细胞相互作用的起始阶段，而T细胞各亚群（CD4+、CD8+T细胞）克隆性增殖、分化和功能的介导，辅助性T细胞（Th）、调节性T细胞（regulatory T cell , Treg）、滤泡辅助性T细胞（Follicular Helper T cell , Tfh）和Th细胞毒性T细胞（CTL）以及Th细胞与B细胞的相互作用，则依赖于另外一些共刺激分子如OX40、4-1BB和ICOS等的参与和调节。因此CD28/B7介导的共刺激信号是免疫应答启动所必需的信号。该信号的调节还可补充TCR信号，并将多种信号整合后启动并调控免疫应答的类型和强度。
（二）共刺激分子在免疫应答不同阶段的表达参与免疫应答适度性的调控
CD28信号可诱导激活T细胞表达多种共刺激分子，这些共刺激分子通过相互协同、相互制约的方式，共同调控免疫应答的平衡和内环境的稳定。CD28信号可主要诱导：①CTLA-4的表达：由于CTLA-4与B7的结合力比CD28高约20左右，与CD28竞争结合B7分子，抑制T细胞从Gl期进入S期，以及IL-2转录因子的活性，从而下调或终止T细胞应答；② OX40的表达：表达在CD4+Th细胞上的OX40，与APC表达的OX40L相互作用后，激发CD4+Th细胞克隆性增殖。还有研究证实，OX40和CD28信号的共同作用还可以介导Th2细胞上调性表达化学趋化因子受体（CXCR5）和分泌IL-4。促使Th2细胞极化，并介导Th2细胞迁移至B细胞滤泡，促使生发中心的形成，增强机体的体液免疫应答；③ 4-1BB的表达：4-1BB主要表达在CD8+T细胞，它与表达在APC上的4-1BBL相互作用后，可激发CD8+ T细胞克隆性增殖并介导其产生效应，同时4-1BB和CD28信号的共作用可影响Th细胞的极化，CD28和4-1BB可促使Th细胞产生IFN-γ，从而分化为Th1型细胞，参与机体的Th1型免疫应答；④ICOS的上调性表达：活化的T细胞上调ICOS的表达，ICOS与B细胞上的相应配基GL50结合后，促进IL-4、IL-10和IFN-γ的产生，从而进一步扩大和增强免疫应答以及介导再次应答，特别是对体液免疫应答的增强作用尤为明显。ICOS/GL50不仅对Th2应答起着重要的调节作用，也参与Th1应答的调节，但其调控的Thl应答是CD28非依赖性的。研究表明ICOS信号对介导抗体产生的滤泡辅助性T细胞（Tfh）有着重要的作用，Tfh定位于淋巴滤泡，辅助B细胞参与体液免疫[6]。⑤FasL的表达增强：活化后的T细胞上调性表达FasL，其与自身或T细胞间的Fas相互结合，导致抗原特异性T细胞的活化诱导细胞凋亡（AICD），通过FasL介导的信号，参与免疫应答的负性调控；⑥PD-1/PD-L1途径对T细胞的调节作用取决于TCR和CD28所提供信号的强度。当在低水平或有限的抗原刺激下，TCR和CD3信号处于低活化阈值状态时，PD-1/PD-L1会导致活化T细胞（特别是一些先前活化过的T细胞）增殖的抑制，并具有拮抗CD28/B7途径的作用，这也是其主要的生物学效应，而当TCR和CD3信号处于最佳活化状态或CD28信号足够强时（尤其在再次免疫应答中），此抑制信号明显削弱。PD-1/PD-L2途径的作用与前者相似，在弱的或有限的抗原刺激的情况下，能抑制T细胞的增殖，并能拮抗CD28/B7所产生的正性信号。但有些报道持相反观点：在亚剂量的抗CD3的联合作用下，PD-L2比B7-1更能显著地刺激T细胞的增殖，并且对CD4+T细胞的作用较CD8+ T细胞强；⑦ BTLA（B and T lymphocyte attenuator）和 CTLA-4和PD-1相似，是又一表达在活化的T细胞表面的抑制性共刺激分子，其配体HVEM则主要表达在免疫细胞、非淋巴组织和某些肿瘤细胞。BTLA/HVEM信号可以阻滞细胞周期，抑制CD4+T和CD8+T细胞的增殖及IL-2等细胞因子的分泌。BTLA、CTLA-4和PD-1与其各自配体结合并在不同的时相以不同的方式调节着免疫应答的起始、放大和中止。
（三）共刺激分子通过双向信号介导免疫细胞之间的相互调控机制
共刺激分子通过配体和受体相互作用的形式在免疫应答启动和调控过程中发挥生物学作用。然而，这种配体作用于受体的作用方式所介导的信号却呈现双向性，即可通过受体介导正向信号发挥生物学作用，也可通过配体介导逆向信号发挥生物学效应。例如，在抗原提呈细胞和T细胞的作用环节，4-1BBL表达于DC、单核巨噬细胞等APC表面，而4-1BB则在T细胞活化启动后诱导性表达。4-1BB/4-1BBL分子对的相互作用下，4-1BB信号（正向信号）促进活化T细胞的生存和增殖，而4-1BBL信号（逆向信号）则介导单核细胞增殖并可在IL-4的协同下促进其向DC分化，这一过程有利于T细胞免疫应答的进一步延长的放大。T细胞活化后期则可以共表达4-1BBL和4-1BB分子，4-1BBL信号则对活化T细胞产生抑制效应[8-9]。
第二节 共刺激分子信号异常与相关疾病
共刺激分子不仅参与T、B细胞的双信号活化，而且在免疫调控过程中发挥着极为重要的作用。共刺激分子信号异常往往引发机体免疫稳态失衡，导致疾病产生。因此，通过研究共刺激分子表达和共刺激信号的异常探讨疾病的免疫病理机制，有助于寻找新型治疗策略。
一、共刺激分子与自身免疫性疾病
（一）正性共刺激分子及其信号异常与自身免疫病
研究表明，Graves病（GD）患者的甲状腺上皮细胞、成纤维细胞和滤泡细胞的共刺激分子表达异常。Graves病患者的甲状腺上皮细胞共同表达CD40和II类分子HLA-DR，浸润淋巴细胞中几乎没有发现凋亡细胞存在，推测CD40提供的共刺激信号能使外周血的自身反应性T淋巴细胞凋亡机制障碍，引起其细胞克隆性增殖及自身免疫反应的持续、迁延甚至恶化。Metcalfe等证实，自身免疫性和非自身免疫性甲状腺滤泡细胞（thyroid follicular cell，TFC）均表达CD40分子，且该分子在T和B细胞的相互作用中起重要的调节功能。CD40/CD40L信号通路直接参与自身免疫应答的形成和维持，所以甲状腺滤泡细胞上调表达CD40分子，可能为甲状腺发生自身免疫应答的一个重要机制。此外，GD病人T细胞CD28表达明显下降，CD4和CD8比例倒置，ICOS分子在GD病人外周血T细胞上异常上调表达。已有研究表明，ICOS信号转导对机体Th免疫反应调节起重要作用，尤其是对Th2反应的调节。ICOS刺激能显著上调IL-10等Th2细胞因子的表达，而IL-10等Th2细胞因子在GD的发生、发展中起着重要作用。因此，从正性共刺激分子及其信号异常入手，有助于对自身免疫病病例机理的阐述以及指导临床治疗及预后判断，并有可能为GD的免疫干预性治疗提供靶点。
（二）负性共刺激分子及其信号异常与自身免疫病
CTLA-4基因多态性亦被认为是GD的独立危险因。而PD-1分子作为负性免疫调控分子在维持外周耐受中发挥了重要的作用，作为PD-1等负性分子及其信号的异常是自身免疫性疾病的重要病理机制。这PD-1基因敲除小鼠C57BL/6-PD-1-/-鼠发生轻微但渐进性的脾肿大，脾脏的B细胞及髓样细胞增多，血清的IgA和IgG2b增加，IgG3增加尤为显著，机体对TI-2抗原的抗IgG3抗体反应显著增强。脾脏的B细胞对抗IgM抗体诱导的增殖反应也增强。C57BL/6-PD-1-/-鼠可随年龄的增长而自发地发生狼疮样增殖性肾小球肾炎和关节炎，肾小球有过度的补体C3和IgG3的沉积，踝关节出现颗粒性结节及骨损伤，而同龄同窝对照鼠则表现正常。当同时导入Fas基因无义突变时，小鼠提早发生增殖性狼疮样自身免疫性疾病，其疾病的严重程度也大大增加，这一结果表明，PD-1和Fas在狼疮样自身免疫性疾病的发生过程中具有协同作用[11]。大部分的BALB/C-PD-1-/-鼠在l0周龄时因充血性心力衰竭而死亡，但2C-TCR-PD-1+/+和BALB/C-PD-1-/--RAG-2-/-鼠则生长良好组织学检查显示整个扩张的心室的心肌细胞间遍布IgG及补体C3的沉积，但却没有淋巴细胞的浸润。进一步的研究表明，自身抗体主要是针对一种表达于正常心肌细胞表面的分子量为33kD的蛋白，与同遗传背景的PD-1+/+对照鼠相比，BALB/C-PD-1-/-鼠的血清中也可检测到这种蛋白。这些结果表明，PD-1在防止BALB/C鼠发生自身免疫性扩张性心肌病方面发挥了重要作用[12]。另外，PD-1/PD-L1信号对淋巴细胞的增殖发挥负性的调控功能，在免疫反应的起始部位和效应部位双重抑制免疫反应，可防止过度的免疫损伤及自身免疫性疾病的发生，有利于维持机体的免疫自稳。随着对PD-1/PD- L1途径的深入研究，有助于深入理解自身免疫性疾病的发病机制，并为其治疗提供新的策略。
二、共刺激分子与肿瘤免疫
（一）激发正性共刺激信号可促进抗肿瘤免疫应答
研究表明，可以通过共刺激分子基因水平的干预、共刺激分子激发型、阻断抗体或重组蛋白运用，激发具有高效杀伤作用的肿瘤特异性CTL促进机体抗肿瘤免疫应答。
研究表明转导B7-1基因的肿瘤细胞株可作为APC有效地激活T细胞，当其与T细胞共培养后，使CD8+T细胞（CD8+/CD25+，CD8+/HLA-DR+ ）明显高于对照组，而CD4+T细胞与对照组无明显差别，这提示B7.1/CD28信号共MHC-I促使CD8+T细胞选择性地活化并扩增。若将4-1BBL和其它共刺激分子基因和B7基因共转入肿瘤细胞，可显著提高肿瘤细胞的免疫原性，将此转基因肿瘤再次接种动物，能有效地抑制肿瘤的生长。
CD40介导的信号对淋巴瘤细胞的生长有重要调节作用。Funakoshi等证实，CD40单抗可以抑制非Burkitt’s淋巴瘤细胞的体外生长，动物实验证实，抗CD40单抗可以明显延长小鼠生存期长达100天[13]，采用人源化抗CD40单抗治疗淋巴瘤也已进入临床Ⅱ期。Weinberg等通过动物实验证实，运用激发型OX40单抗可阻止小鼠肿瘤形成，同时提高荷瘤小鼠的生存率[14]。联合运用OX40单抗和IL-2在小鼠肿瘤模型的过继性免疫治疗中也取得良好效果，使得肺和脑转移灶消除。在小鼠的多种肿瘤模型中，包括肉瘤、乳腺癌、肠癌、神经胶质瘤和黑色素瘤等运用OX40/OX40L的治疗策略均获得成功。Broll等的动物实验研究表明，通过肿瘤抗原免疫联合4-1BB单抗治疗MCA205瘤和GC261神经胶质瘤，可介导低免疫原性肿瘤消退。将4-1BB单抗联合IL-12治疗，结果发现不但可使IL-12的用量减少18倍，而且此类动物的带瘤生存时间明显延长，皮下转移灶消失，较两者单用效果更佳并具有显著性差异[15]。
共刺激信号激发对T淋巴细胞的有效激发和扩增有着潜在的临床应用价值。CD28激发型单抗可明显诱导肿瘤特异性CTL的体外增殖，其增强程度与B7转基因细胞相当，并可避免CTLA-4引发的负性调控作用。CD28激发型单抗可提供给T细胞更持久的激活信号，引发更强有力的抗肿瘤效应。OX40/OX40L信号可增强T细胞的体外增殖和促进产生多种细胞因子[16]。4-1BB/4-1BBL介导的信号可以诱导T细胞的有效活化、增殖及抗凋亡作用，维持T细胞的生存，4-1BBL激发的肿瘤特异性CTL，产生长久的抗肿瘤效应[17]。
2、共刺激分子突变体与肿瘤免疫
CD40信号激发抗肿瘤免疫应答及其存在问题：随着人们对CD40分子研究的不断深入，发现CD40分子广泛表达于多种肿瘤组织和细胞，例如CD40分子在血液系统肿瘤如恶性B淋巴瘤、多发性骨髓瘤和B淋巴细胞性白血病异常高表达，并在70%的上皮性肿瘤如乳腺癌、胃癌、肠癌、脑胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌等[18]。体内外实验均已证实：激发一些恶性肿瘤细胞（乳腺癌、恶性B淋巴瘤等）的CD40分子可明显抑制肿瘤细胞的增殖，上调肿瘤细胞CD80、CD54以及MHC-II等分子的表达，甚至直接诱导细胞凋亡；然而，相反的结果亦时有报道，如急性B淋巴细胞性白血病CD40分子激发后，则有明显的促增殖效应，因此CD40分子作为肿瘤治疗的靶分子已引起人们的广泛关注。然而，随着研究的深入，CD40分子与血管生成的关系及其在机体多种细胞上的广泛表达所导致的严重副作用，成为进行肿瘤免疫治疗的瓶颈。在易发生肿瘤的转基因小鼠中，CD40介导的新生血管形成与早期肿瘤发生密切相关[19]。另有研究显示血管内皮细胞表达的CD40分子能够介导血管生成，从而为肿瘤细胞提供营养和转移途径，参与了肿瘤的早期发生过程并促进肿瘤生长[19,20]。还有研究表明在小鼠体内静脉注射CD40单抗通过激活B细胞可导致迟发性肝脏炎症性病变[21]。因此针对CD40分子靶向治疗的安全性和确切疗效如何，尚需进一步评估。
CD40突变体及其在抗肿瘤免疫应答中的应用：有关CD40分子的研究发现[22]，部分上皮细胞性肿瘤存在该分子的突变，突变位点位于CD40胞外段第二个富含半胱氨酸的区域（CAC→CAA，78His→78Gln）（NCBI Assay Id:ss23134804，Reference SNP Id：rs17177493），这一区域是CD40与CD40L相互作用的重要区域。由于在种系进化过程中第78位组氨酸高度保守，因此推测该点突变会对CD40正常功能产生重要影响。我们就该点突变进行二级和三级结构的预测，结果显示该点突变导致CD40胞外段78位氨基酸附近的螺旋结构发生明显改变，很可能影响此处CD40胞外段的三级结构。初步的结构模拟显示，野生型CD40的胞外段78H苯环上的N原子和74E的O原子之间可以形成氢健，以维持局部构象的稳定，而突变后78Q与74E之间的氢键被破坏，表现出明显的斥力，使该部分的结构域发生明显的变化，该突变很可能导致CD40局部构象发生改变，严重影响了该结构域结构上的稳定性、削弱了CD40与CD40L的结合能力。研究还发现该突变体在上皮性肿瘤细胞广泛表达，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、部分胃癌组织中，尤为重要的是该突变体在正常组织或体液中尚未发现。大样本肿瘤新鲜标本（胃癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌和胶质瘤等）的免疫组织化学研究表明，CD40mu78AA主要表达于分化程度差，恶性程度高的肿瘤细胞上，据此推测正是由于CD40mu78AA竞争抑制了正常CD40分子（CD40wt）逆向激发CD40L的能力，从而使肿瘤抗原特异性T细胞不能有效激活，从而导致肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤。这些发现为利用CD40突变体开展肿瘤生物诊断和靶向分子治疗开拓了新途径。
3、靶向负性共刺激分子的干预与肿瘤免疫逃逸
B7家族负性共刺激分子：B7-H1（PD-L1）、B7-H3（CD276）和B7-H4，是近年颇受关注的参与肿瘤免疫逃逸的分子。这些分子被发现在人类多种肿瘤中表达，与肿瘤的临床发病因素及预后密切相关，进一步对其表达的调节和参与免疫逃逸的机制研究将为寻找更有效的肿瘤免疫干预开拓新途径。
（1）PD-L1与肿瘤免疫逃逸
多种不同组织来源的肿瘤细胞表达PD-L1，包括部分肺癌细胞系、卵巢癌细胞系、乳腺癌、淋巴癌、黑色素瘤、成纤维细胞瘤以及胃癌等。现在的研究普遍认为，肿瘤细胞表面表达PD-L1与表达在T细胞上的受体PD-1相互作用，导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，是PD-L1介导肿瘤免疫逃逸的主要机制[23]。此外，PD-L1在乳腺癌肿瘤细胞中的表达水平和肿瘤的组织学分型、雌激素受体及孕酮受体表达水平显著相关，乳腺癌组织中PD-L1＋T细胞和Foxp3 Treg在数量上呈显著正相关，并且Foxp3 Treg、PD-L1＋T细胞及PD-1＋T细胞在乳腺癌中的浸润程度同时与患者的组织学分型、孕酮受体表达水平显著相关，提示了诸多负性调控的TILs在肿瘤中的浸润，在相当程度上弱化了肿瘤细胞的免疫原性。Hamanishi等[24]在卵巢癌中发现，肿瘤细胞PD-L1的表达水平和CD8+T的浸润程度负相关，且PD-L1表达水平和患者预后负相关，而CD8+T的浸润程度和患者预后正相关。转染PD-L1的人黑色素瘤细胞株624mel可以诱导CD8+CTL的凋亡，动物实验表明植入PD-L1-肿瘤的小鼠体内肿瘤特异性T细胞显著增加，而植入PD-L1+肿瘤小鼠体内的T细胞出现凋亡。上述研究结果认为，PD-L1信号介导的肿瘤免疫逃逸主要是通过与PD-1的相互作用诱导T细胞的凋亡而实现的。最新的研究表明，有些配体分子也具有介导信号作用，称之为逆向信号。肿瘤表达的PD-L1分子很可能具有这样一个能传递逆向信号的分子。在动物模型中，PD-L1+的肿瘤更能抵御CTL的杀伤，PD-L1的表达和免疫治疗疗效成反比。去除PD-L1-PD-1信号能够重新发挥CTL治疗功效[25-27]。这提示PD-L1-PD-1信号可能在肿瘤细胞表面形成了一个“分子壁垒”，发挥对肿瘤细胞的保护作用。Lieping Chen等的最新研究显示，PD-L1是一个存在于肿瘤细胞的抗凋亡受体，PD-L1传递给肿瘤细胞的抗凋亡能力还能抵御化学药物的诱导凋亡作用。这种逆向信号的传递形成了肿瘤细胞表面的分子保护机制[28]。这为PD-L1-PD-1信号的作用机制又提出了新的设想，即PD-L1可经PD-1相互作用后传递给肿瘤细胞有利于生长的逆向信号，从而促进肿瘤的发生和发展。PD-L1胞浆内并不含有明显的分子结构介导上述的效应，因此推测可能存在某些接头分子参与逆向信号的传递，但其胞浆内段含有的PKC磷酸化位点可能是其逆向信号转导的结构基础。
PD-L1表达受IFN-γ、IL-4、TNF-α和VEGF等多种细胞因子诱导，其中IFN-γ作用最强。绝大多数人肿瘤细胞株均不表达PD-L1，但经IFN-γ诱导后呈高水平表达[29]。同时，IFN-γ还可诱导正常上皮细胞、血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和骨髓DC细胞高表达PD-L1[29]。多项研究结果表明，PD-L1在不同细胞上表达的调节机制不同。IFN-γ可通过MyD88/TRAF6-MEK/ERK/STAT1信号通路上调PD-L1在多发性骨髓瘤患者浆细胞上表达[30]，或者通过下调miR-513的表达，在转录后水平调节PD-L1在胆管上皮细胞上的表达[31]。此外，Parsa等[32]研究发现，在神经胶质细胞瘤中，PI3K/AKT信号通路通过激活mTOR/S6K1信号上调PD-L1表达；而Marzec等[33]发现，PD-L1在T淋巴瘤细胞上表达上调是由NPM/ALK激活转录因子STAT3所致。
（2）B7-H3与肿瘤免疫逃逸
研究发现B7-H3分子在多个肿瘤组织中表达并与临床相关。肺癌、尿路移形细胞癌、肾癌、神经母细胞瘤以及前列腺癌组织中均能检测到该分子的表达， B7-H3被认为是肿瘤相关抗原，可以作为一些肿瘤的靶分子。例如：肺癌，前列腺癌以及神经母细胞瘤细胞的表面标记分子。临床研究表明肿瘤组织中B7-H3的表达与肿瘤转移以及预后密切相关。相关研究表明，B7-H3表达与肿瘤淋巴结转移密切相关，与肿瘤组织浸润T淋巴细胞数量呈负相关。B7-H3在前列腺癌组织中表达的临床意义尤为引人关注，Chavin等发现B7-H3表达强阳性的前列腺癌细胞更容易发生骨转移[34]。对前列腺癌手术根治术的组织标本进行免疫组化分析，发现在检测的所有肿瘤组织中都能检出B7-H3的表达，其表达强度与前列腺癌术后复发存在显著的相关性，B7-H3表达强度越高，其术后复发率也越高。同时，在前列腺癌细胞上的B7-H3表达与肿瘤转移、术后越倾向复发以及死亡率密切相关。然而也有研究认为B7-H3可以作为胃癌预后良好的指标。目前，关于B7-H3如何参与并调节肿瘤免疫应答的机制还待进一步研究。
（3）B7-H4与肿瘤免疫逃逸
B7-H4分子在众多肿瘤组织中呈过表达，包括原发性乳腺癌、转移性乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌和子宫内膜腺癌等等，浸润性导管癌和小叶癌中B7-H4分子的表达尤其强烈。且孕激素受体以及HER-2/neu表达低、未接受新辅助化疗患者呈现B7-H4分子的高表达，B7-H4阳性的乳腺癌细胞数量明显增加。对非小细胞肺癌的研究发现，B7-H4表达与患者年龄、性别、抽烟史以及肿瘤分化程度无关，但与淋巴结转移关系密切。而Krambeck等人在研究了B7-H4强阳性表达的肾细胞癌（RCC）患者后则发现，肿瘤细胞B7-H4的表达与肾细胞癌临床和病理学特征相关，这包括：患者的全身症状、肿瘤的坏死、肿瘤大小、核分级以及临床分期等。不仅如此，与B7-H4阴性的患者相比，高表达B7-H4的肾细胞癌患者最终死于癌症的风险要高3.05倍。如果癌细胞同时表达B7-H4和PD-L1，则癌细胞的浸润程度则更高，RCC患者最终死于癌症的几率也越大。此外，Simon[35]等研究还发现B7-H4能以可溶性形式存于血液和体液中，卵巢癌患者血清和腹水中的sB7-H4含量显著高于正常人和生殖系统有良性病变的妇女。鉴于其更高的检出率、特异性和稳定性，联合检测B7-H4和CA125两个指标，将大大提高卵巢癌诊断的准确性。肿瘤组织异常表达B7-H4分子与肿瘤组织CD3+和CD8+的浸润细胞数量明显减少相关，而肿瘤微环境中高表达B7-H4的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）也能有效地抑制活化CD8+T细胞的增殖，促进肿瘤的生长和转移。对CTL的这种抑制效应，运用siRNA干扰TAM中B7-H4的表达后明显改善。进一步研究还发现，肿瘤微环境中高浓度的IL-6和IL-10能上调TAM上B7-H4的表达（呈剂量依赖性）。此外，调节性T细胞（Treg）也能通过诱导抗原提呈细胞APC分泌IL-10来促使APC上调表达B7-H4，形成有助肿瘤免疫逃逸的“调节性APC”细胞。
最近我们的研究发现，B7-H4蛋白分子不仅含信号肽序列，还含有核定位序列，该分子不仅可定位于细胞膜上，还可定位于细胞核[36]。对临床肾癌样本分析，发现肾癌组织中B7-H4既可表达于细胞膜，也可表达于细胞核，并且表达于细胞膜和细胞核的B7-H4都与肿瘤的临床分期相关，但只有细胞膜B7-H4于肿瘤浸润淋巴细胞呈负相关。进一步的研究发现，肿瘤细胞中表达的B7-H4分子在肿瘤进展中通过两种方式发挥作用，一种是定位到肿瘤细胞膜上，以负性共刺激分子的方式与活化T细胞膜上的相应受体结合，抑制T细胞的增殖，促进肿瘤的免疫逃逸；另一种是转位到细胞核，影响细胞周期，促进肿瘤细胞自身的增殖作用，这一方式的具体机制尚待进一步研究。
三、共刺激分子与移植免疫应答
无论是移植物抗宿主反应还是宿主抗移植物反应为主的移植免疫病理过程中，共刺激分子及其信号发挥了重要作用。因此，通过干预在免疫应答不同阶段发挥主导作用的共刺激分子及其信号，驱动机体重新回归免疫稳态耐受移植物长期生存是重要的研究方向和应用策略。
CD40/CD40L共刺激信号在T细胞活化启动、CD28诱导表达和T细胞增殖分化中发挥重要作用，提示阻止其信号具有诱导免疫耐受的作用。采用抗CD40L单抗能延长实验动物移植物的存活时间，若与供者的脾细胞或CTLA-Ig联合使用，可取得更好的效果。还有实验表明，联合应用抗CD40和抗CD28单抗封闭CD40和CD28两条活化通路，将明显延长皮肤和心脏移植物的存活。在rhrsus猴肾移植时使用抗CD40抗体（合并使用或无CTLA4-Ig），均有明显的效果。但是在人体的临床试验产生意外的效果，首次抗CD40L单克隆抗体在人体移植试验结果显示后，部分病人出现严重的出血和血小板功能障碍，提示CD40/CD40L信号在维持血小板和凝血功能中极为重要。阻断CD40信号会产生严重的副作用[37]。
4-1BB/4-1BBL信号是维持活化T细胞生存并延长其免疫应答过程，在移植免疫过程中参T细胞介导的移植排斥免疫应答，并能加速移植物抗宿主病（GVHD）的发生。如激发型4-1BB单抗能加速异基因心脏移植后的排斥反应。同时，在皮肤移植动物模型中也证实了这一点。因此，调节4-1BB/4-1BBL信号为临床异基因骨髓移植提供了新的治疗策略。
另外，有研究表明CTLA4-Ig融合蛋白和CD40L抗体虽然能阻断动物的急性排斥反应，但对慢性排斥反应无明显作用，使用ICOS蛋白或特异性抗ICOS抗体能显著抑制移植物排斥和相关细胞因子的产生，由此表明ICOS介导的Thl反应在移植物慢性排斥反应中起着不可忽视的作用[38,39]。
1. Baruch K, Deczkowska A, Rosenzweig N, et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Med. 2016, 22(2): 135-137.
2. Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 2014, 515(7528): 568-571.
3. Adams AB, Ford ML, Larsen CP. Costimulation Blockade in Autoimmunity and Transplantation: The CD28 Pathway. J Immunol. 2016, 197(6): 2045-2050.
4. Paul w F, Seder R A. Lymphcyte responses and cytokines. Cell. 1994, 76(2): 241-251.
5. Dustin M L, Cooper J A. The immunological synapses and the actin cytoskeleton:molecular hardware for T cell signaling. Nat Immunol. 2000, 1(1): 23-29.
6. Tangye SG, Ma CS, Brink R, et al. The good, the bad and the ugly - TFH cells in human health and disease. Nature Reviews Immunology. 2013,13(6): 412-426.
7. Latchman Y, Wood C R, Chemova T, et al. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibit T cell activation. Nat Immunol. 2001, 2(3): 261-268.
8. Ju S, Ju S, Ge Y, et al. A novel approach to induce human DCs from monocytes by triggering 4-1BBL reverse signaling. Int Immunol. 2009, 21(10): 1135-1144.
9. Harfuddin Z, Dharmadhikari B, Wong SC, et al. Transcriptional and functional characterization of CD137L-dendritic cells identifies a novel dendritic cell phenotype. Sci Rep. 2016, 6: 29712.
10. Chen L, Han X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. J Clin Invest. 2015, 125(9): 3384-3391.
11. Nishimura H, Nose M, Hiai H, et al. Development of 1upus-like autoimmune diseases by diseases by disruption of the PD-1 gene encoding and ITIM motifcarrying immunreceptor. Immunity. 1999, 11(2): 141-151.
12. Nishimura H, Okazaki T, Tanaka Y, et al. Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-l receptor-deficient mice. Science. 2001, 291(5502): 319-322.
13. Funakoshi S, Longo D L, Beckwith M, et al. Inhibition of human B-cell lymphoma growth by CD40 stimulation. Blood. 1994, 83(10): 2787-2794.
14. Weinberg A D, Rivera M M, Prell R J, et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J Immunol. 2000, 164(4): 2160-2169.
15. Martinet O, Divino C M, Zang Y, et al. T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4-1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancer.Gene Ther. 2002, 9(12): 786-792.
16. Gramaglia I, Weinberg A D, Lemon M, et al. OX-40 ligand: a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell response. J Immunol. 1998, 161(12): 6510-6517.
17. Langstein J, Michel J, Schwarz H. CD137 induces proliferation and endomitosis in monocytes. Blood. 1999, 94(9): 3161-3168.
18. Murugaiyan G, Agrawal R, Mishra GC, et al. Differential CD40/CD40L expression results in counteracting antitumor immune responses. J Immunol. 2007, 178(4): 2047-2055.
19. Bergmann S, Paolo Pandolfi P. Giving blood:a new role for CD40 in tumorigenesis.J Exp Med. 2006, 203(11): 2409-2412.
20. Chiodoni C, Iezzi M, Guiducci C, et al. Triggering CD40 on endothelial cells contributes to tumor growth. J Exp Med. 2006, 203(11): 2441-2450.
21. Kemura K, Moriwake H, Nagake M, et al. Pathogeneic role of B cells in anti-CD40-induced necor inflammatory liver disease. Am J Pathol. 2006, 168(3): 786-795.
22. Chun-Jian Qi, Lu Zheng, Hong-Bing Ma, et al. A Novel Mutation in CD40 and Its Functional Characterization. Human mutation. 2009, 30(6): 985-994.
23. Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: A potential mechanism of immune evasion. Nat Med. 2002, 8(8): 793-800.
24. Hamanishi J, M Mandai, M Iwasaki, et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007, 104(9): 3360-3365.
25. Dong H, Zhu G, Koji Tamada, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med. 1999, 5(12):1365-1369.
26. Freeman GJ, Long AJ，Iwai Y, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med. 2000, 192(7):1027-1034.
27. Dong HD, Strome SE, Eric L. Matteson, et al. Costimulating aberrant T cell response by B7-H1 autoantibodies in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 2003, 1(11):363-370.
28. Azema T, Yao S, Zhu G, et al. B7-H1 is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells. Blood. 2008, 111(7):3635-3643.
29. Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med. 2002, 8(8): 793-800.
30. Liu J, Hamrouni A, Wolowiec D, et al. Plasma cells from multiple myeloma patients express B7-H1 (PD-L1) and increase expression after stimulation with IFN-gamma and TLR ligands via a MyD88-, TRAF6-, and MEK-dependent pathway. Blood. 2007, 110(1): 296-304.
31. Gong AY, Zhou R, Hu G, et al. MicroRNA-513 regulates B7-H1 translation and is involved in IFN-gamma-induced B7-H1 expression in cholangiocytes. J Immunol. 2009, 182(3): 1325-1333.
32. Parsa AT, Waldron JS, Panner A, et al. Loss of tumor suppressor PTEN function increases B7-H1 expression andimmunoresistance in glioma. Nat Med. 2007, 13(1): 84-88.
33. Marzec M, Zhang Q, Goradia A, et al. Oncogenic kinase NPM/ALK induces through STAT3 expression of immunosuppressive protein CD274 (PD-L1, B7-H1). Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(52): 20852-2087.
34. Chavin G, Sheinin Y, Crispen PL, et al. Expression of immunosuppresive B7-H3 ligand by hormone-treated prostate cancer tumors and metastases. Clinical Cancer Research. 2009, 15(6): 2174-2180.
35. Simon I, Katsaros D, Rigault L I, et al. B7-H4 is over-expressed in early-stage ovarian cancer and is independent of CA125 expression. Gynecol Oncol. 2007, 106(2): 334-341.
36. 36.L Zhang, H Wu, D Lu, G Li, C Sun, H Song, et al. The costimulatory molecule B7-H4 promote tumor progression and cell proliferation through translocating into nucleus. Oncogene. 2013, 32(46):5347-5358.
37. Daley S R, Cobbold S P, Waldmann H, et al. Fc-disabled anti-mouse CD40L antibodies retain efficacy in promoting transplantation tolerance. Am J Transplant. 2008, 8(11):2265-2271.
38. Ogawa E, Gao W, Shemmeri N, et al. Important of ICOS-B7RP-1 costimulation in acute and chronic allograft rejection. Nat Immunol. 2001, 2(7): 597-596.
39. Guo L, Li X K, Funeshima N, et a1. Prolonged survival in rat liver transplantaion with mouse rnonoclonal antibody against an inducible costimulatory (ICOS). Transplantation. 2002, 73(7): 1027-1032.
第三节 一些重要共刺激分子在疾病发生中的作用与临床意义
近年来，新型共刺激分子的克隆及其生物学功能的研究拓展了共刺激分子介导的免疫调控机制的理论体系；靶向共刺激分子干预和调节机体免疫应答成为肿瘤和自身免疫病的新型治疗手段，同时又由于免疫调节的复杂性使得这些策略在应用过程中又面临着新的问题。
一、伴随诊断PD-L1免疫组化检测的现状及研究进展
肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞等表达PD-L1与表达在T细胞上的受体PD-1相互作用，导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，构成了PD-L1介导肿瘤免疫逃逸的主要机制。大量的临床研究证实PD-L1免疫组化（IHC）抗体可用于特定肿瘤类型的样本检测，以预测患者对PD-1/PD-L1抑制剂治疗的反应。最早应用PD-L1免疫组织化学（IHC）测定法，对病理标本组织结构和肿瘤微环境进行评估的是临床治疗非小细胞肺癌NSCLC的pembrolizumab和nivolumab单抗[1, 2]。进一步研究发现不同品牌的PD-L1 IHC检测试剂在检测方法、检测条件和阳性判读等方面并无统一标准[3]，而临床的广泛应用要求PD-L1 IHC测定法具有可重复性和高精确性，提供一种全面评估肿瘤微环境中肿瘤细胞（TC）和免疫细胞（IC）PD-L1表达水平的病理诊断方法。
鉴此，Blueprint项目联合产学研机构使用多种PD-L1 IHC检测抗体(22C3, 28-8, SP142, SP263)，对NSCLC组织样本进行病理分析和临床评估，上述PD-L1 IHC单抗分别来自DAKO，Spring Bioscience，Ventana，Cell Signaling，Biocare Medical，Abcam，Zeta Corporation，采用不同的检测平台Autostainer Link 48、Ventana Benchmark Ultra、Ventana Benchmark XT和Lab Vision Autostainer 480S。结果表明22C3、28-8和SP263在肿瘤细胞的PD-L1阳性染色具有一致性，而SP142对肿瘤细胞染色较少，更多的阳性染色定位在免疫细胞[4]。为了探究SP142 PD-L1单抗对免疫细胞优势染色的内在机制，研究人员将几种PD-L1抗体通过microarray antibody profiling进行了结合位点的氨基酸图谱分析，发现28-8，SP263和SP142结合的PD-L1位点有部分重叠，SP142还与两个PD-1肽段显示出交叉活性，这就解释了为什么SP142会对免疫细胞产生特异性染色[5]。
Schats团队在开展肺癌和黑色素瘤的肿瘤细胞和免疫细胞的免疫组化研究中称，特异性的PD-L1 IHC检测抗体和方法决定了特定细胞类型或细胞定位的染色特征，更换检测体系会使PD-L1抗体对TC和IC敏感性产生较明显改变，进而影响临床cut-off值和PD-L1检测结果的准确判读[3]。目前Mayo Clinic为肿瘤患者提供三种克隆的PD-L1 IHC伴随诊断抗体22C3，SP263和SP142
(https://www.mayocliniclabs.com/it-mmfiles/PD-L1_Immunohistochemistry_Options.pdf)
。每个克隆适用于不同的免疫抑制剂药物和肿瘤类型，各自具有独特的染色特点和判读指针，评分方法取决于肿瘤类型、恶性程度，患者之前接受的治疗方法等。
（撰写人：黄子逸 13913557771）
1. Roach C, Zhang N, Corigliano E, et al., Development of a Companion Diagnostic PD-L1 Immunohistochemistry Assay for Pembrolizumab Therapy in Non-Small-cell Lung Cancer. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2016, 24(6): 392-397.
2. Phillips T, Simmons P, Inzunza H D, et al., Development of an automated PD-L1 immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell lung cancer. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2015, 23(8): 541-549.
3. Schats K A, Van Vré E A, Boeckx C, et al., Optimal Evaluation of Programmed Death Ligand-1 on Tumor Cells Versus Immune Cells Requires Different Detection Methods. Arch Pathol Lab Med, 2018, 142(8): 982-991.
4. Tsao M S, Kerr K M, Kockx M, et al., PD-L1 Immunohistochemistry Comparability Study in Real-Life Clinical Samples: Results of Blueprint Phase 2 Project. J Thorac Oncol, 2018, 13(9): 1302-1311.
5. Kintsler S, Cassataro M A, Drosch M, et al., Expression of programmed death ligand (PD-L1) in different tumors. Comparison of several current available antibody clones and antibody profiling. Ann Diagn Pathol, 2019, 41: 24-37.
二、B7H3在肿瘤免疫应答中的特性及其临床检测意义
B7-H3于2001年从人树突状细胞cDNA文库中首次克隆出来。早期的B7-H3被认为是一种正性共刺激分子，能够正性调控T细胞产生免疫活化效应[1]。但随着研究的深入，越来越多的研究显示B7-H3更多地展现出负性共刺激分子的效应，包括抑制Th1细胞活性，促进免疫抑制细胞因子产生，促进肿瘤免疫逃逸等[2]。然而，B7-H3的受体至今尚未发现。曾有研究发现TLT-2可以作为B7-H3的受体发挥功能，但存在争议，并且也应该不是唯一的受体，因为B7-H3具有正性和负性的双重作用，很可能通过不同受体发挥功能[3]。除了受体的研究，B7-H3还被发现可以与一些结合蛋白，如IL20RA，MVP等结合发挥生物学功能。此外， B7-H3的非免疫学效应最近也越来越多地受到关注。不仅在骨分化、炎症反应以及代谢等多种疾病和功能中B7-H3都扮演非免疫功能的角色，在肿瘤细胞中B7-H3也可以不依赖于免疫效应而独立地通过调控肿瘤细胞生物信号发挥功能[4]。B7-H3可以通过多种信号途径直接参与多种肿瘤细胞的肿瘤进展、化疗药物敏感性以及糖酵解，包括PI3K/Akt、Jak/STAT、NF-κB-p65/MAPK-p38和Ras/Raf/MEK等信号[5]。B7-H3能够在多种癌症类型的肿瘤患者组织中检测到并异常表达，并预测预后不良，因此B7-H3可以作为一个候选的癌症治疗靶点。到目前为止，针对B7-H3作为肿瘤治疗靶点，已有3种具有ADCC或ADC作用的抗B7-H3的单克隆抗体正在进行至少11项一期临床试验，并取得了相当不错的初步结果[5]。此外，B7-H3已被广泛地用作CAR-T细胞（B7-H3.CAR-Ts）的作用靶点，在体外和小鼠体内有效地控制肿瘤细胞，且无明显毒性[6]。尽管受体尚未阐明，B7-H3由于其独特的功能吸引了越来越多地基础和临床研究。
（撰写人：曹磊 13914067011）
1. Chapoval AI, Ni J, Lau JS, Wilcox RA, Flies DB, Liu D, Dong H, Sica GL, Zhu G, Tamada K et al: B7-H3: a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production. Nat Immunol. 2001, 2(3): 269-274.
2. Suh WK, Gajewska BU, Okada H, Gronski MA, Bertram EM, Dawicki W, Duncan GS, Bukczynski J, Plyte S, Elia A et al: The B7 family member B7-H3 preferentially down-regulates T helper type 1-mediated immune responses. Nat Immunol. 2003, 4(9): 899-906.
3. Hashiguchi M, Kobori H, Ritprajak P, Kamimura Y, Kozono H, Azuma M: Triggering receptor expressed on myeloid cell-like transcript 2 (TLT-2) is a counter-receptor for B7-H3 and enhances T cell responses. Proc Natl Acad Sci USA. 2008, 105(30): 10495-10500.
4. Picarda E, Ohaegbulam KC, Zang X: Molecular Pathways: Targeting B7-H3 (CD276) for Human Cancer Immunotherapy. Clin Cancer Res. 2016, 22(14): 3425-3431.
5. Karine Flem-Karlsen, Øystein Fodstad, Ming Tan, and CarolineE.Nunes-Xavier：B7-H3 in Cancer–Beyond Immune Regulation. Trends in cancer. 2018, 4(6): 401-404.
6. Theruvath J, Sotillo E, Mount CW, Graef CM, Delaidelli A, Heitzeneder S, Labanieh L, Dhingra S, Leruste A, Majzner RG et al: Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors. Nat Med. 2020, 26(5): 712-719.
三、B7-H4在肿瘤免疫应答中的特性与作用
B7-H4，又被称作B7S1、B7x及VTCN1，是由Chen等人于2003年利用生物信息学的方法发现的B7家族最新成员[1]。人B7-H4的cDNA全长约1.8kb，位于人的染色体1p11.1，在基因组上跨越66kb，含有6个外显子和5个内含子。序列分析表明，B7-H4的开放阅读框（ORF）由849个碱基组成，编码一个含282个氨基酸的多肽，包括信号肽、一对VC免疫球蛋白胞外段、跨膜区和胞质区。B7-H4 mRNA 在外周组织中广泛表达，但在正常组织中几乎检测不到B7-H4蛋白的表达。至今，B7-H4的受体尚未确认。
B7-H4信号在机体的免疫应答调节中发挥重要的生物学效应。研究证实，固相化的B7-H4-Ig融合蛋白或细胞膜表面的B7-H4对由CD3 mAb活化的T细胞增殖有很强的抑制作用，并能显著下调细胞因子的分泌。可溶性B7-H4-Ig融合蛋白不能抑制T细胞的增殖，但却能在体外部分抑制异源性细胞毒性T淋巴细胞的产生。B7-H4在人类肿瘤组织中的表达具有重要的临床意义，许多人类肿瘤组织中的肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞都异常表达B7-H4分子[2-4]，且其表达水平与患者临床病理特征及预后密切相关。B7-H4介导的免疫应答调节对自身免疫和炎症具有重要意义，B7-H4表达缺乏会加重系统性红斑狼疮以及自身免疫性糖尿病等多种自身免疫性疾病的病理生理表现，用特异抗体封阻细胞的B7-H4后可增强CTL的应答，加速EAE疾病的发生[5]。
B7-H4可负调控T细胞介导的免疫应答，促进肿瘤免疫逃逸，参与肿瘤进展。B7-H4可抑制CD8+T细胞的增殖，导致CD8+T细胞的细胞因子分泌能力及细胞毒性作用减弱，从而诱导CD8+T细胞的耗竭，促进肿瘤的进展，而B7-H4的阻断剂可逆转T细胞耗竭，与PD-1的阻断剂能协同增强CD8+TILs的抗肿瘤免疫能力，改善肿瘤免疫疗法的疗效[6]。此外，B7-H4还可以促进肿瘤微环境中M2型巨噬细胞、Tregs、骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）等免疫抑制细胞的浸润，抑制抗肿瘤免疫[7]。也有研究表明，B7-H4可介导细胞内的致癌信号通路，促进肿瘤的进展。B7-H4包含一个核定位序列，可使其进入细胞核，促进肿瘤细胞的增殖以及抑制细胞凋亡[3]。此外，B7-H4高表达可诱导上皮间质转化（EMT），促进肿瘤细胞的侵袭和转移[8]。
（撰写人：丁思思 18862111004）
1. Sica GL, Choi IH, Zhu G, Tamada K, Wang SD, Tamura H, Chapoval AI, Flies DB, Bajorath J, Chen L. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity. Immunity. 2003, 18(6): 849-861.
2. Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, Zhu G, Wei S, Mottram P, Brumlik M, Cheng P, Curiel T, Myers L et al. B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J Exp Med. 2006, 203(4):871-881.
3. Zhang L, Wu H, Lu D, Li G, Sun C, Song H, Li J, Zhai T, Huang L, Hou C et al. The costimulatory molecule B7-H4 promote tumor progression and cell proliferation through translocating into nucleus. Oncogene. 2013, 32(46): 5347-5358.
4. Chen LJ, Sun J, Wu HY, Zhou SM, Tan Y, Tan M, Shan BE, Lu BF, Zhang XG. B7-H4 expression associates with cancer progression and predicts patient's survival in human esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 2011, 60(7): 1047-1055.
5. Podojil JR, Liu LN, Marshall SA, Chiang MY, Goings GE, Chen L, Langermann S, Miller SD. B7-H4Ig inhibits mouse and human T-cell function and treats EAE via IL-10/Treg-dependent mechanisms. J Autoimmun. 2013, 44:71-81.
6. Li J, Lee Y, Li Y, Jiang Y, Lu H, Zang W, Zhao X, Liu L, Chen Y, Tan H et al. Co-inhibitory Molecule B7 Superfamily Member 1 Expressed by Tumor-Infiltrating Myeloid Cells Induces Dysfunction of Anti-tumor CD8(+) T Cells. Immunity. 2018, 48(4): 773-786 e775.
7. Abadi YM, Jeon H, Ohaegbulam KC, Scandiuzzi L, Ghosh K, Hofmeyer KA, Lee JS, Ray A, Gravekamp C, Zang X. Host b7x promotes pulmonary metastasis of breast cancer. J Immunol. 2013, 190(7):3806-3814.
8. Xie N, Cai JB, Zhang L, Zhang PF, Shen YH, Yang X, Lu JC, Gao DM, Kang Q, Liu LX et al. Upregulation of B7-H4 promotes tumor progression of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cell Death Dis. 2017, 8(12): 3205.
四、B7-H5的生物学特性及其在肿瘤免疫应答中的作用
B7-H5（或称VISTA,c10orf54, PD-1H, DD1α, Gi24, Dies1和SISP1）是B7家族负性调控分子之一，2011年由Noelle RJ.和Chen L.两个研究小组首先发现[1]。人和小鼠的B7H5主要在腹腔巨噬细胞、CD11b+单核细胞、CD11c+树突状细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等髓系细胞中表达[1]。
Robert J等发现B7-H5在酸性pH下，例如在肿瘤微环境中，通过细胞外结构域与粘附和共抑制受体P-选择蛋白糖蛋白配体1（PSGL-1）结合，进而抑制T细胞功能。更重要的是，通过抗体阻断B7-H5/PSGL-1相互作用足以逆转体内B7-H5介导的免疫抑制作用[2]。
最新的研究表明B7-H5是幼稚T静息和外周耐受的重要检查点调节因子[3]。B7-H5的敲除破坏了主要的静态幼稚T细胞亚群并增强了自身反应性。与之相反，B7-H5信号活化通过促进抗原诱导的外周T细胞缺失而增加了T细胞耐受性。文章同样指出B7-H5调控幼稚T细胞的作用在炎症条件下是无效的。
研究表明B7-H5在自身免疫性疾病发挥重要的免疫调节作用。例如，2019年，研究发现B7-H5在人皮肤系统性红斑狼疮，盘状红斑狼疮和模型小鼠病变部位免疫细胞上高表达；而B7-H5激活性抗体可以明显减少皮肤疾病，自身抗体，炎性细胞因子，趋化因子和免疫细胞扩增[4]。
B7-H5作为重要的免疫检查点分子调控肿瘤免疫已被广泛接受[5]。B7-H5在原发的黑色素瘤和口腔鳞状细胞癌组织上高表达并与患者的不良预后呈正相关性。研究表明B7-H5阻断抗体可以显著提升肿瘤微环境中CD4+和CD8+ T细胞的数量，抑制MDSC和Foxp3+CD4+Treg细胞的比例，进而抑制肿瘤的发生发展。重要的是，B7-H5敲除小鼠表现出明显的抗肿瘤免疫活性。
（撰写人：石通国 18262058960）
1. Ni L，et al. New checkpoints in cancer immunotherapy. Immunological reviews. 2017, 276(1): 52-65.
2. Robert J, et al. VISTA is an acidic pH-selective ligand for PSGL-1. Nature. 2019, 574(7779): 565-570.
3. Mohamed A, et al. VISTA is a checkpoint regulator for naïve T cell quiescence and peripheral tolerance. Science. 2020, 367(6475): eaay0524.
4．Xue et al. PD-1H (VISTA)–mediated suppression of autoimmunity in systemic and cutaneous lupus erythematosus. Sci Transl Med. 2019, 11(522): eaax1159.
5. Geng et al. The expression and immunoregulation of immune checkpoint molecule VISTA in autoimmune diseases and cancers. Cytokine Growth Factor Rev. 2020, 52:1-14.
五、B7-H6的生物学特性及其在肿瘤免疫应答中的作用
B7-H6（又名NCR3LG1）作为B7家族新成员于2009年由Brandt报道发现[1]。人B7-H6基因位于11号染色体p15.1，其编码蛋白是由454个氨基酸构成（51kDa）的I型跨膜糖蛋白，胞外段由一个IgV和一个IgC结构域组成，含有多个潜在N糖基化位点；胞内段包含多个信号基序，如ITIM、SH2以及SH3结合基序[2]。B7-H6是NK细胞活化受体NKp30的唯一已知胞膜受体，B7-H6的蛋白结构和二者的相互作用关系在除小鼠外的哺乳动物演化中相对保守。
B7-H6在天然免疫调节中发挥重要作用。研究表明[3]，单核细胞以及中性粒细胞在由TLR激动剂如TNFα和IL-1β活化时，会上调表达B7-H6从而更有效的激活NK细胞的杀伤功能。在HHV-6、HCMV和HIV感染中，病毒会通过多种方式下调宿主细胞B7-H6的表达，从而逃避NK细胞的识别。最新研究发现，B7-H6是唯一在内质网应激中上调表达的NK细胞配体。B7-H6在肿瘤免疫中也发挥重要作用。研究表明，B7-H6在大多数正常成人组织中均未发现表达，而在大多数肿瘤组织中都高表达，是一种肿瘤特异性蛋白。B7-H6的表达与多种肿瘤的发展相关，表明B7-H6可能存在多种机制参与肿瘤免疫逃逸。肿瘤细胞会利用MMP9（ADAM-10/-17）切割而产生sB7-H6[4]，不仅使肿瘤表面功能性B7-H6丢失，而且切割产生的sB7-H6能阻断NK细胞受体，导致NK细胞表面NKp30的下调，进而介导肿瘤的免疫逃逸。在神经母细胞瘤中，NKp30的亚型决定着B7-H6/NKp30结合后对NK细胞的影响[5]，其中NKp30C的激活则会使NK细胞分泌IL-10，抑制肿瘤免疫应答。而在急性髓系白血病中，肿瘤表达B7-H6能通过ILC2-MDSC轴抑制免疫杀伤能力[6]。此外，多项研究表明，肿瘤细胞表达的B7-H6 具有促进细胞增殖和抗凋亡的能力。因此，B7-H6具有成为一个有效肿瘤免疫治疗靶点的潜力。有证据表明，多种肿瘤治疗策略就能提高肿瘤细胞B7-H6的表达并增强NK细胞杀伤敏感性。已有研究使用B7-H6和CD20抗体的融合蛋白的双功能性，可以同时介导NK细胞的激活以及增强NK细胞的脱颗粒作用，从而增强对肿瘤细胞的杀伤能力。利用NKp30蛋白对TCR进行编辑而产生的CAR-T能对表达B7-H6的肿瘤细胞进行有效的杀伤[7]。B7-H6融合HER2-scFv能显著增强NK细胞对HER2+乳腺癌的ADCC效应。
因此，B7-H6是肿瘤诊断、评估肿瘤治疗预后的一个有效生物标记物；并且作为治疗干预靶点，在肿瘤免疫治疗中具备巨大潜力。
（撰写人：傅丰庆 18914030599）
1. Bjornsen, E. G., Thiruchelvam-Kyle, L., Hoelsbrekken, S. E., Henden, C., Saether, P. C., Boysen, P., Daws, M. R. and Dissen, E. B7H6 is a functional ligand for NKp30 in rat and cattle and determines NKp30 reactivity toward human cancer cell lines. European journal of immunology. 2019, 49: 54-65.
2. Brandt, C. S., Baratin, M., Yi, E. C. et al. The B7 family member B7-H6 is a tumor cell ligand for the activating natural killer cell receptor NKp30 in humans. The Journal of experimental medicine. 2009, 206: 1495-1503.
3. Matta, J., Baratin, M., Chiche, L. et al. Induction of B7-H6, a ligand for the natural killer cell-activating receptor NKp30, in inflammatory conditions. Blood. 2013, 122: 394-404.
4. Schlecker, E., Fiegler, N., Arnold, A. et al. Metalloprotease-mediated tumor cell shedding of B7-H6, the ligand of the natural killer cell-activating receptor NKp30. Cancer research. 2014, 74: 3429-3440.
5. Semeraro, M., Rusakiewicz, S., Minard-Colin, V. et al. Clinical impact of the NKp30/B7-H6 axis in high-risk neuroblastoma patients. Science translational medicine. 2015, 7: 283ra255.
6. Trabanelli, S., Chevalier, M. F., Martinez-Usatorre, A. et al. Tumour-derived PGD2 and NKp30-B7H6 engagement drives an immunosuppressive ILC2-MDSC axis. Nature communications. 2017, 8: 593.
7. Zhang, T., Wu, M. R. and Sentman, C. L. An NKp30-based chimeric antigen receptor promotes T cell effector functions and antitumor efficacy in vivo. J Immunol, 2012, 189: 2290-2299.
六、B7-H7的生物学特性及其在肿瘤中的表达意义
B7-H7，又称为HHLA2，是1999年发现的Ig超家族新成员[1]。在系统搜索人类逆转录病毒长末端重复序列（LTR）时发现该基因，这些LTR具有增强子、启动子或多腺苷酸化功能，其中一个基因被鉴定为B7-H7。
B7-H7基因位于人类染色体的3q13.13区，临近B7-1和B7-2基因。B7-H7是I型跨膜分子，含有414个氨基酸序列。B7-H7在人单核细胞上组成型表达，在未成熟树突细胞上不表达，但经炎症信号如LPS、IFN-γ刺激诱导后可在B细胞上表达，但在T 细胞表面，即使经过刺激，B7-H7仍不表达[2]。B7-H7在大多数人类正常组织中不表达，仅在胎盘滋养层细胞和肾脏、肠道组织、胆囊、乳腺的上皮细胞少量表达，但在多种人类恶性肿瘤，包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等，存在B7-H7高表达。
跨膜和免疫球蛋白结构域2 (Transmembrane and immunoglobulin domain containing 2, TMIGD2)是B7-H7的受体之一[3]。TMIGD2存在于染色体19q13.3，含有5个外显子，长10.2kb[4, 5]，为31kDa的蛋白质，其蛋白在氨基酸序列上与其他CD28家族分子的同源性大于10%[4]。
目前，B7-H7的研究面临的主要问题和挑战包括以下几点：①TMIGD2是其受体之一，其第二受体尚未明确，需探究第二受体的结构及生物学功能；②先前的研究较少涉及 HHLA2作用的信号转导通路，需进一步探索；③B7-H7不表达于鼠、兔等等啮齿动物，限制了其在动物中的研究，需寻找合适的动物研究模型；④迄今为止，尚没有针对 HHLA2的抑制剂应用于临床；⑤B7-H7与B7x、B7-H3同属于B7家族的第三组成员，但目前这些免疫检查点是如何协同起作用的还需要进一步的研究。
（撰写人：陈陆俊 13776858368）
1. Mager DL, Hunter DG, Schertzer M, Freeman JD: Endogenous retroviruses provide the primary polyadenylation signal for two new human genes (HHLA2 and HHLA3). Genomics. 1999, 59(3): 255-263.
2. Zhao R, Chinai JM, Buhl S, Scandiuzzi L, Ray A, Jeon H, Ohaegbulam KC, Ghosh K, Zhao A, Scharff MD et al: HHLA2 is a member of the B7 family and inhibits human CD4 and CD8 T-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110(24): 9879-9884.
3. Rahimi N, Rezazadeh K, Mahoney JE, Hartsough E, Meyer RD: Identification of IGPR-1 as a novel adhesion molecule involved in angiogenesis. Mol Biol Cell. 2012, 23(9): 1646-1656.
4. Zhu Y, Yao S, Iliopoulou BP, Han X, Augustine MM, Xu H, Phennicie RT, Flies SJ, Broadwater M, Ruff W et al: B7-H5 costimulates human T cells via CD28H. Nat Commun. 2013, 4: 2043.
5. Janakiram M, Chinai JM, Fineberg S, Fiser A, Montagna C, Medavarapu R, Castano E, Jeon H, Ohaegbulam KC, Zhao R et al: Expression, Clinical Significance, and Receptor Identification of the Newest B7 Family Member HHLA2 Protein. Clin Cancer Res. 2015, 21(10): 2359-2366.
七、TIM-3的生物学特性及其与疾病的关系
T细胞免疫球蛋白粘液素3（T cell immunoglobulin and mucin-3, TIM3）在2002年首次发现，又称HAVCR2，属于TIM家族成员。在人类，TIM家族包括TIM-1、TIM-3和TIM-4，位于染色体5q33.2上。在小鼠中，TIM家族包括TIM-1到TIM-8，位于染色体11B1.1上。TIM-3是由 281 个氨基酸组成的I型膜蛋白，包含一个胞外区、一个单跨膜结构域和一个C-末端细胞质尾部。
Tim-3最初被鉴定为高度分化的Th1细胞和分泌IFN-g的CD8+ T 细胞的特异性标志物，不表达于初始T细胞和Th2细胞上。TIM-3作为一种负调控的免疫检查点，存在于不同类型的免疫细胞中，包括T细胞、调节性T细胞(Tregs)、树突状细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和肥大细胞。
TIM-3有四个配体，包括半乳糖凝集素-9(Gal-9)、癌胚抗原细胞粘附分子-1(Ceacam-1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和磷脂酰丝氨酸(PtdSer)。Gal-9是第一个被识别的配体，它是一种碳水化合物结合蛋白，特异性地识别TIM-3免疫球蛋白可变区(IgV)中的N-连接糖链结构，可通过刺激钙内流至Th1细胞胞内引起其凋亡。PtdSer不是Tim-3的独特配体，Tim-1、Tim-3和Tim-4都能与PtdSer结合，Tim-3与PtdSer的结合涉及凋亡细胞的摄取和树突状细胞的交叉呈递。Tim-3与HMGB1的结合干扰了其与死亡细胞释放的DNA的结合，从而有效地抑制了天然免疫应答的激活和促炎细胞因子的产生。Ceacam-1和TIM-3存在共表达，以顺式和反式结合，两种相互作用均可驱动TIM-3的抑制功能[1]。
TIM-3调节免疫功能的作用在EAE、I型糖尿病、自身免疫性心肌炎及肝炎的小鼠模型中均已被报道，采用TIM-3抗体治疗会加重EAE模型疾病的严重程度，TIM-3-Ig融合蛋白或TIM-3抗体通过阻断TIM-3介导的免疫耐受可加速自身免疫性糖尿病的进展。在人类疾病中TIM-3的失调研究主要集中在多发性硬化症，多发性硬化症患者检测到低表达TIM-3、高分泌IFN-g的T细胞，提示TIM-3的下调可能是炎症性自身反应性T细胞存在的机制之一，除了多发性硬化症，表达TIM-3的T细胞比例的减少也出现在银屑病和溃疡性结肠炎中。
在多种肿瘤类型中例如肝癌、宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、肾癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤[2]，TIM-3表达于肿瘤浸润的淋巴细胞以及外周血肿瘤抗原特异性T细胞，TIM-3通过介导T细胞衰竭抑制抗肿瘤免疫应答，阻断TIM-3信号可增强T细胞IFN-g的分泌。多种异位肿瘤移植小鼠模型显示大多数TIM-3阳性的肿瘤浸润T细胞也表达PD-1，值得注意的是，TIM-3+ PD-1+肿瘤浸润T细胞分泌IFN-g、TNF-a、IL-2的水平明显低于TIM-3- PD-1+ T细胞。越来越多的临床预实验数据表明TIM-3抑制剂或将提高肿瘤免疫治疗的疗效，而来自大量动物实验的数据表明TIM-3抑制剂与其他免疫卡控点分子的联合将更为有效[3, 4]。
（撰写人： 瞿秋霞 13912608130）
1. Tang R, Rangachari M, Kuchroo VK. Tim-3: A co-receptor with diverse roles in T cell exhaustion and tolerance. Semin Immunol. 2019, 42: 101302.
2. Solinas C, De Silva P, Bron D, Willard-Gallo K, Sangiolo D. Significance of TIM3 expression in cancer: From biology to the clinic. Semin Oncol. 2019, 46: 372-379.
3. Du W, Yang M, Turner A, Xu C, Ferris RL, Huang J, Kane LP, Lu B. TIM-3 as a Target for Cancer Immunotherapy and Mechanisms of Action. Int J Mol Sci. 2017,18: 645.
4. He Y, Cao J, Zhao C, Li X, Zhou C, Hirsch FR. TIM-3, a promising target for cancer immunotherapy. Onco Targets Ther. 2018,11: 7005-7009.
八、TIGIT的生物学特性及其在肿瘤表达的意义
TIGIT（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）又名WUCAM，Vstm3，VSIG9，是免疫球蛋白（Ig）超家族的一个成员。TIGIT最初由Jane L Grogan等[1] 对T细胞上特异性表达并具有潜在抑制受体的蛋白结构域进行基因搜索发现。其具有一个细胞外免疫球蛋白可变序列（IgV）、一个1型跨膜结构域、一个典型免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和一个免疫球蛋白酪氨酸尾部（ITT）基序的细胞内结构域。TIGIT只在淋巴细胞中表达，主要是在CD4+效应性T（effector T）细胞、CD4+调节性T（regulatory T）细胞、CD4+滤泡辅助T（follicular helper T）细胞、CD8+效应性T（effector T）细胞及自然杀伤（natural killer，NK）细胞上。脊髓灰质炎病毒受体(PVR，也称为Necl5或CD155)，是TIGIT的高亲和力受体。此外，PVRL2（也被称为Nectin 2或CD112）也能与TIGIT结合，但亲和力比PVR弱很多。目前TIGIT信号转导主要在NK细胞中进行研究。在小鼠NK细胞中，TIGIT通过ITT-like基序或ITIM基序的酪氨酸残基磷酸化实现其功能。与PVR结合后，ITT-like基序中Y225的磷酸化并与细胞质适配器Grb2结合，Grb2可招募肌醇磷酸酶-1 (SHIP1)抑制磷酸肌醇3激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，导致NK细胞功能下调；此外，ITT-like基序中的酪氨酸磷酸化还可以通过结合β- arrestin 2和招募SHIP1从而阻止TNF受体相关因子TRAF6的泛素化从而阻止NF -κB激活，致使 NK细胞分泌IFN-γ减少。而在人类NK细胞中的研究表明TIGIT功能需要ITIM中的Y231磷酸化从而发挥抑制功能。
现有研究表明，TIGIT在肺癌[2]、黑色素瘤[3]、胃癌[4]、滤泡淋巴瘤[5]等多种肿瘤浸润CD8+ T及Treg细胞中表达增加，肿瘤局部的Treg细胞释放的抑制性细胞因子及大量丧失功能的CD8+ T细胞使肿瘤细胞无法被清除从而促进肿瘤生长。此外，TIGIT在肿瘤浸润的NK细胞中表达增高并阻碍其杀伤肿瘤细胞作用，从而促进肿瘤的发展[6]。2018年，发现在结肠癌患者癌组织中NK细胞表达的TIGIT明显多于癌旁组织，进一步的动物成瘤实验证实了肿瘤中的NK细胞TIGIT表达升高，同时TIGIT+PD-1+的CD8+ T细胞在肿瘤组织中也明显增多，IFN-γ、TNF等细胞因子表达下调，提示CD8+ T细胞及NK细胞因表达TIGIT而功能受损，使用TIGIT抗体阻断后，肿瘤明显缩小，小鼠存活率显著增加[13]；进一步联合PD-1抗体治疗效果更佳。
（撰写人：？）
1. Yu X, Harden K, Gonzalez LC, Francesco M, Chiang E, Irving B, Tom I, Ivelja S, Refino CJ, Clark H, Eaton D, Grogan JL. 2009. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells. Nat Immunol 10:48-57.
2. Johnston RJ, Comps-Agrar L, Hackney J, Yu X, Huseni M, Yang Y, Park S, Javinal V, Chiu H, Irving B, Eaton DL, Grogan JL. 2014. The immunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8(+) T cell effector function. Cancer Cell 26:923-937.
3. Chauvin JM, Pagliano O, Fourcade J, Sun Z, Wang H, Sander C, Kirkwood JM, Chen TH, Maurer M, Korman AJ, Zarour HM. 2015. TIGIT and PD-1 impair tumor antigen-specific CD8(+) T cells in melanoma patients. J Clin Invest 125:2046-58.
4. He W, Zhang H, Han F, Chen X, Lin R, Wang W, Qiu H, Zhuang Z, Liao Q, Zhang W, Cai Q, Cui Y, Jiang W, Wang H, Ke Z. 2017. CD155T/TIGIT Signaling Regulates CD8(+) T-cell Metabolism and Promotes Tumor Progression in Human Gastric Cancer. Cancer Res 77:6375-6388.
5. Josefsson SE, Huse K, Kolstad A, Beiske K, Pende D, Steen CB, Inderberg EM, Lingjaerde OC, Ostenstad B, Smeland EB, Levy R, Irish JM, Myklebust JH. 2018. T Cells Expressing Checkpoint Receptor TIGIT Are Enriched in Follicular Lymphoma Tumors and Characterized by Reversible Suppression of T-cell Receptor Signaling. Clin Cancer Res 24:870-881.
6. Mandal R, Senbabaoglu Y, Desrichard A. 2016. The head and neck cancer immune landscape and its immunotherapeutic implications. 1:e89829.
7. Zhang Q, Bi J, Zheng X, Chen Y, Wang H, Wu W, Wang Z, Wu Q, Peng H, Wei H, Sun R, Tian Z. 2018. Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity. Nat Immunol 19:723-732.
九、免疫检查点分子CD47在肿瘤转移和免疫治疗中的作用
CD47（分化簇47）是一种细胞表面糖蛋白，CD47是在大多数细胞中表达但通常在肿瘤细胞上过表达的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白（Ig）超家族，可与整合素，血小板反应蛋白和信号调节蛋白α（SIRPα）相互作用。SIRP-α和CD47之间的相互作用决定了细胞与细胞之间的功能，这可能会影响血液微环境和一系列免疫环境中肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭以及免疫细胞的活化和凋亡[1, 2]。
CD47是参与迁移过程的细胞表面分子之一，在跨内皮迁移中具有很好的作用。据报道[3]，具有高侵袭和转移能力的癌细胞与CD47呈正相关。有研究表明[4]，CD47在子宫内膜异位症相关的卵巢癌中高表达。CD47促进人上皮性卵巢癌细胞系TOV-112D和21G细胞的生长，且介导TOV-21G癌细胞系的迁移与侵袭。MicroRNA-133a可以靶向抑制CD47蛋白来抑制喉癌细胞的增殖，迁移和侵袭。据报道，高级别浆液性卵巢癌患者细胞中较高的CD47表达与可能从巨噬细胞逃逸然后倾向于转移的患者预后差相关。在卵巢癌细胞中的相关功能研究还表明，CD47的过表达显着促进了迁移和侵袭。另外，上皮-间质转化（EMT）是一种由上皮细胞转变为间充质干细胞的过程。CD47通过调节高级浆液性卵巢癌细胞（HGSOC）上的E-cadherin和N-cadherin诱导EMT。
CD47调节重组上皮细胞中的肌动蛋白细胞骨架，参与细胞粘附和细胞迁移。CD47途径由Src家族和MEK / MAPK（促分裂原激活的蛋白激酶/促分裂原激活的蛋白激酶）介导。据报道，CD47通过激活胶质母细胞瘤上的PI3k / Akt途径促进细胞侵袭。CD47的激活导致人类星形细胞瘤而非正常星形胶质细胞通过Akt依赖性途径增殖。抗CD47抗体或CD47敲低能够抑制由于TSP-1表达增加而导致的皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）肿瘤细胞的增殖和存活。另外，有研究表明，CD47 / PI3K / Akt信号传导途径是微生物来源的葡萄球菌超抗原样蛋白6（SSL6）抑制糖酵解作用来增强索拉非尼对HCC细胞的敏感性的重要信号通路。CD47促进结直肠癌（CRC）细胞的生长和转移，CD47与烯醇化酶-1(ENO1)相互作用并保护它免受泛素介导的降解，从而促进CRC细胞中糖酵解活性和ERK的磷酸化，表明CD47在细胞代谢方面也有重要作用。
通过免疫调节方法获得的抗肿瘤作用已在临床上应用。将特异性抗体靶向抗原，是一种有效的癌症治疗方法。已有研究发现，在大鼠骨肿瘤模型中，CD47单克隆抗体可在体外驱动巨噬细胞吞噬骨肿瘤细胞，从而抑制大鼠的肿瘤转移。人源化的抗CD47抗体破坏CD47-SIRPα抗吞噬轴是治疗恶性小儿脑肿瘤的有效方法[5]。施用CD47阻断抗体可在体外诱导人巨噬细胞吞噬小细胞肺癌（SCLC）细胞，并体内抑制SCLC肿瘤的生长[6]。阻断CD47的表达除了促进巨噬细胞吞噬作用外，还与增强的T细胞介导的免疫原性肿瘤清除有关。
协同药物或抗体广泛用于研究中，并且与单独使用相比，协同药物可以提高药物疗效。一种双特异性抗体衍生物，称为RTX（利妥昔单抗）-CD47，串联包含两个与CD47特异性结合的抗体片段。利妥昔单抗是一种可在人CD20中使用的人-鼠嵌合单克隆抗体。CD20是一种在所有B细胞表面表达的蛋白质。因此，RTX-CD47通过更好的巨噬细胞介导的吞噬作用来抑制CD47阳性癌细胞上的CD47-SIRPα，从而在调节先天免疫细胞方面比抗CD47抗体更有效。抗CD47抗体疗法联合化疗DOX可以调节自噬并预防心脏毒性，从而抑制浸润性乳腺癌的生长。用CD47和阿霉素协同治疗后，小鼠心脏组织活性和功能的系统保护。
CD47可用作诊断癌前肿瘤的指标。CD47与它的配体信号调节蛋白α（SIRP-α）相互作用，影响一系列细胞活动，并在免疫系统和体内平衡中发挥重要作用。首先，阻断CD47 /SIRP-α途径的试剂可提供最大的抗肿瘤功效，且毒性最小。肿瘤细胞表达高CD47，且与多种肿瘤不良预后相关，是患者癌症诊断和预后的靶点。同时发现CD47不仅参与肿瘤细胞的增殖和迁移，还在细胞糖酵解中发挥重要作用。因此，面对如此好的靶标，开发了相应的抗体，在阻断CD47和治疗肿瘤中起着重要作用。抗CD47抗体与其他药物（如利妥昔单抗，DOX）可在体内和体外产生更好的治疗效果。因此，考虑到CD47检查点功能的广阔潜力，可以肯定的是CD47在肿瘤的治疗，肿瘤转移和预诊断中起着重要的作用。
（撰写人：傅丰庆 18914030599）
1. Barclay AN, Brown MH. The SIRP family of receptors and immune regulation[J]. Nat Rev Immunol. 2006, 6(6): 457-464.
2. Matozaki T, Murata Y, Okazawa H, et al. Functions and molecular mechanisms of the CD47-SIRPalpha signalling pathway[J]. Trends Cell Biol. 2009, 19(2): 72-80.
3. [3] Li Y, Lu S, Xu Y, et al. Overexpression of CD47 predicts poor prognosis and promotes cancer cell invasion in high-grade serous ovarian carcinoma[J]. Am J Transl Res. 2017, 9(6): 2901-2910.
4. Cooper D, Lindberg FP, Gamble JR, et al. Transendothelial migration of neutrophils involves integrin-associated protein (CD47) [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995, 92(9): 3978-3982.
5. Gholamin S, Mitra SS, Feroze AH, et al. Disrupting the CD47-SIRPalpha anti-phagocytic axis by a humanized anti-CD47 antibody is an efficacious treatment for malignant pediatric brain tumors[J]. Sci Transl Med. 2017, 9(381).
6. Weiskopf K, Jahchan NS, Schnorr PJ, et al. CD47-blocking immunotherapies stimulate macrophage-mediated destruction of small-cell lung cancer[J]. J Clin Invest. 2016, 126(7): 2610-2620.
第四节 可溶性共刺激分子在自身免疫性疾病检测中的应用
在人血清和血浆中，存在各种可溶性的共刺激分子（co-stimulatory molecules）。到目前为止，通过ELISA和Western等方法证实大部分共刺激分子都存在可溶性形式。这些可溶性分子的产生往往由两种形式：其一、由mRNA的不同拼接形成，由比膜型蛋白少了跨膜区和胞内区的转录本直接翻译成可溶性蛋白。B7/CD28家族许多分子的可溶性形式是通过这种方式形成的，如sCD80、sCD86、sCD28、sCTLA-4、sPD-1和sBTLA等。TNF/TNFR超家族成员WSI-1/DR3、CD95和4-1BB也通过这种方式产生可溶性分子。其二、从膜型蛋白脱落而来，即通过蛋白酶酶切从膜上剪切胞外段形成分子可溶性。TNF/TNFR超家族中许多分子的可溶性形式通过这种方式形成，如sTNFR1、sNGFR、sCD40、sCD30、sCD27、sTNF-α、sTNF-β、sCD40L和sCD95L等，而sWSI-1/sDR3、sCD95和s4-1BB由不同的转录本翻译形成。通过这种方式形成可溶性形式的还有CD28/B7家族中的PD-L1和B7-H3分子。也有些蛋白，虽然已经检测到了其可溶性形式的存在，如B7-H4和OX40L等，但它们的形成方式还有待进一步的研究。
可溶性共刺激分子具备重要的免疫调节功能，它们可以与相应的受体或配体结合，直接激发共刺激信号，或者阻断膜型蛋白与相应配体的结合，抑制膜型分子传递的信号，它们也可以与游离的可溶性受体或配体结合，阻止其与膜型分子结合。由此，可溶性分子是共刺激网络的重要组成部分，并参与共刺激分子途径的自我调节。一些研究发现，在正常人的血清中，这些可溶性共刺激分子的表达水平比较低，而在疾病状态的体液中，可溶性分子水平会有异常的增高，而且具有重要的临床相关性。
多种可溶性共刺激分子如sCD28、sCD25、sCD275、sOX40L、sCD40L参与了自身免疫性疾病生理性和病理性免疫应答的免疫调节[1,2]。
CD28是广泛分布于T细胞表面的I型跨膜糖蛋白受体，与其配体B7-1和B7-2结合，为T细胞的初始活化提供重要的正性共刺激信号。研究表明，sCD28表达在干燥综合症、系统性红斑狼疮和系统性皮肤硬化症病人的血清中提高。也有研究发现sCD28在贝塞特氏症和类风湿性关节炎的病人血清中含量比健康人群中高出很多，并且sCD28的表达水平与贝塞特氏症的病情相关，在血管炎的贝塞特氏症病人血清中sCD28含量更高，表明sCD28的表达水平可用于评估贝塞特氏症病情程度[3,4]。
共刺激分子ICOS主要在活化的T细胞上表达，与配体ICOSL相互作用，对Tfh的形成和功能维持至关重要，可以促进生发中心形成和抗体分泌。自身免疫病如系统性红斑狼疮、重症肌无力患者血浆中可溶性ICOSL异常表达，与疾病活动度和临床指标密切相关，提示ICOS/ICOSL的异常活化可能介导了自身反应性T细胞的异常活化和自身抗体的产生，进而影响自身免疫病的发病机制[5,6]。
共刺激分子OX40L作为TNF超家族成员，在与其受体 OX40 相互作用后，能够促进适应性免疫应答反应提供共刺激信号激活效应 T 细胞，有效地促进 T 细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌。研究发现，sOX40L表达水平与年龄正相关，在老年人血清中其表达水平明显偏高。在自身免疫性疾病如Graves’病和过敏性紫癜、肾病综合征、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和干燥综合征患者血清中表达水平明显升高，且与病情呈正相关，提示sOX40L很可能参与了自身免疫性疾病的发生发展，对于该可溶性分子的检测将有助于自身免疫性疾病的诊断[7,8]。
共刺激分子CD40/CD40L是免疫和炎症反应中重要的效应分子。sCD40L通过与血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表达的sCD40相互作用，促进炎症反应，提示过表达sCD40L可能与动脉粥样硬化板块形成、发展和破裂有关。研究发现II型糖尿患者代谢紊乱促使血小板活性增强，活化血小板表达，促使sCD40L表达增加。类风湿关节炎患者外周血清sCD40L 与疾病活动度密切相关[9]。多项研究显示血清sCD40L可以作为急性冠脉综合征、早期脑卒中等心血管疾病的危险因子和早期预测生物学标志物[10]。
可溶性CTLA-4（sCTLA-4）参与了诸多自身免疫病的免疫调节，在甲状腺疾病、1型糖尿病、系统性皮肤硬化症、系统性红斑狼疮、肌肉衰弱和早期脊柱关节病等病人的血清中都有高水平的表达，因此，sCTLA-4已经成为自身免疫病免疫失调的一个检测指标。最新的研究表明，sCTLA-4在未治疗的腹腔系统病人血清中表达较高，可以作为衡量黏膜破损程度的指标[11,12]。
共刺激分子CD25（IL-2R）通常表达于活化的T细胞表面。CD25可以从细胞表面释放，以可溶性形式存在，包括感染性疾病、移植排斥、自身免疫炎症状态、某些恶性肿瘤中均检测到外周血sCD25升高。研究发现系统性红斑狼疮患者血清sCD25水平显著升高，并与疾病平分、肾脏损伤程度、C反应蛋白水平、24小时蛋白尿具有显著相关性，提示sCD25可以作为评价系统性红斑狼疮肾脏损伤的重要危险因素。此外，血清 sCD25水平与类风湿关节炎、多发性硬化疾病活动度密切相关，表明sCD25可能参与了类风湿关节炎和多发性硬化等自身免疫病的炎症过程，并有望成为自身免疫性疾病的一种新的炎症指标。
（撰写人：刘翠平 15050157626）
1. Huang C, Zhu HX, Yao Y, Bian ZH, Zheng YJ, Li L, Moutsopoulos HM, Gershwin ME, Lian ZX. Immune checkpoint molecules. Possible future therapeutic implications in autoimmune diseases.J Autoimmun. 2019, 104:102333.
2. Hoefsmit EP, Rozeman EA, Haanen JBAG, Blank CU. Susceptible loci associated with autoimmune disease as potential biomarkers for checkpoint inhibitor-induced immune-related adverse events.ESMO Open. 2019, 4(4): e000472.
3. Sun Z, Yi L, Tao H, Huang J, Jin Z, Xiao Y, Feng C, Sun J.Enhancement of soluble CD28 levels in the serum of Graves' disease.Cent Eur J Immunol. 2014, 39(2): 216-22
4. Hebbar M, Jeannin P, Magistrelli G, Hatron PY, Hachulla E, Devulder B, Bonnefoy JY, Delneste Y. Detection of circulating soluble CD28 in patients with systemic lupus erythematosus, primary Sjögren's syndrome and systemic sclerosis.Clin Exp Immunol. 2004, 136(2):388-92.
5. Her M, Kim D, Oh M, Jeong H, Choi I. Increased expression of soluble inducible costimulator ligand (ICOSL) in patients with systemic lupus erythematosus.Lupus. 2009, 18(6): 501-507.
6. Xue Q, Li X, Gu Y, Wang X, Wang M, Tian J, Duan X, Gao H, Ji X, Yan X, Dong W, Fang Q, Zhang X. Unbalanced Expression of ICOS and PD-1 in Patients with Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder.Sci Rep. 2019, 9(1): 14130
7. An J, Ding S, Hu X, Sun L, Gu Y, Xu Y, Hu Y, Liu C, Zhang X. Preparation, characterization and application of anti-human OX40 ligand (OX40L) monoclonal antibodies and establishment of a sandwich ELISA for autoimmune diseases detection.Int Immunopharmacol. 2019, 67: 260-267.
8. Cui D, Lv Y, Yuan X, Ruan G, Zhang Y, Yan C, Xu D, Lv M, Mao Y, Cao J, Jin J, Xie J. Increased Expressions of OX40 and OX40 Ligand in Patients with Primary Immune Thrombocytopenia.J Immunol Res. 2019, 2019: 6804806.
9. Román-Fernández IV, García-Chagollán M, Cerpa-Cruz S, Jave-Suárez LF, Palafox-Sánchez CA, García-Arellano S, Sánchez-Zuno GA, Muñoz-Valle JF.Assessment of CD40 and CD40L expression in rheumatoid arthritis patients, association with clinical features and DAS28.Clin Exp Med. 2019, 19(4): 427-437.
10. Angelou A, Antoniou E, Garmpis N, Damaskos C, Theocharis S, Margonis GA.The Role of Soluble CD40L Ligand in Human Carcinogenesis.Anticancer Res. 2018, 38(5): 3199-3201
11. Saverino D, Simone R, Bagnasco M, Pesce G. The soluble CTLA-4 receptor and its role in autoimmune diseases: an update. Auto Immun Highlights. 2010, 1(2): 73-81.
12. Czaja AJ. Immune inhibitory proteins and their pathogenic and therapeutic implications in autoimmunity and autoimmune hepatitis.Autoimmunity. 2019, 52(4):144-160.
第六节 结语
共刺激信号的作用并非仅限于对T细胞的激发，赋予T细胞第二信号，或单纯地增强（正性）免疫应答效应，这一系列共刺激分子（膜型和可溶性）可能在免疫应答的不同阶段不仅通过正性信号介导免疫应答的启动、激发、扩大和增强，而且通过负性信号精确地调节免疫应答的程度和持续的时间，从而达到免疫调节的平衡状态。机体如此复杂的免疫应答可能是通过数量众多、功能多样、相互调节及制约的共刺激信号而介导的，但随之产生的问题是，如此多的共刺激分子在免疫应答中的作用是相互交叉叠加，还是在不同阶段各自发挥作用?它们之间如何相互作用、调节或制约以达到整体效应?由于机体免疫应答是免疫系统的生理活动，它必将涉及到这些共刺激分子和信号的整体作用，而这些作用在动态、消长和调节中是如何展示的？所以还需建立新方法或新技术，系统动态地分析这一系列共刺激分子以及相关因子在免疫应答中的调节性表达、相互作用、信号传递及其相关机制；同时，必须通过体外和体内的实验性免疫应答进行比较性研究，以及免疫功能异常相关疾病（肿瘤、感染和自身免疫性疾病等）与健康个体比较性分析，才能系统而全面地理解共刺激分子在机体免疫应答中的确切作用及其机制，从而开发正确、适度地调控特异性免疫应答新技术，开创临床转化新途径，为相关疾病的诊断和治疗提供新的靶点和方案。
